[發明專利]一種生物法合成異戊烯醇的方法

有效

• 申請號: 201210243034.4
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN103540558A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 咸漠;鄭艷寧;劉煒
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/63;C12P7/04;C12R1/19
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 紀曉峰

技術領域

本發明涉及異戊烯醇化合物的生物合成，具體地涉及一種重組大腸桿菌工程菌株、該菌株的制備方法以及利用該重組大腸桿菌工程菌株合成異戊烯醇化合物的方法。?

背景技術

異戊烯醇又名3-甲基-2-丁烯-1-醇(3-Methyl-2-butene-1-ol)，相對分子質量為86.13，密度0.848g/CB，沸點140℃，閃點43℃，為無色透明液體，在水中的溶解度為170g/L(20℃)。異戊烯醇主要用于合成高效低毒農藥擬除蟲菊酯類殺蟲劑的中間體賁亭酸酯(以甲酯、乙酯為主)，以及其下游產品二氯菊酸酯、DV菊酰氯(二氯菊氯)等，另外還可作為合成香料的中間體。目前的三種合成路線各有優缺點：(1)以異丁烯為原料的方法，反應在高溫高壓下進行，條件苛刻，且設備投資較大；(2)以異戊二烯為原料的方法，氯化氫參與反應，反應相對較為容易，但對設備腐蝕性較大，而且存在反應物醋酸鈉分離困難的問題；(3)以丙酮為原料的方法源于乙炔化工，原料成本高于石油化工，由于我國是乙炔大國，故本法較適合國情。但此法須在貴金屬催化劑存在的情況下進行催化加氫，使得反應操作復雜，成本升高。?

為異戊烯醇的生產提供更有效更綠色的方法將是本技術領域的進步。一種有可能的解決方法是利用生物合成途徑來生產異戊烯。工程大腸桿菌具有生長速度快、發酵周期短、遺傳背景清楚、易于工程化操作、可利用廉價的可再生資源等特點，因此工程大腸桿菌作為生物催化劑已成為近年來生產生物基化學品的有效手段。Genencor和Goodyear公司則是將外源的MVA途徑重組入大腸桿菌細胞中，進而再利用MVA途徑的終產物二甲基丙烯基焦磷酸作為直接前體來轉化生產異戊二烯(美國專利公開，2009/0203102)。MVA途徑首先在甲基戊二酰輔酶A合成酶和羥甲基戊二?酰輔酶A還原酶的作用下利用糖來合成甲羥戊酸，然后甲羥戊酸再在甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的作用下轉化為異戊烯基焦磷酸(IPP)，IPP再在異戊烯基焦磷酸異構酶的作用下轉化為二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)。?

高特異性生產異戊烯醇可以簡化產物分離，從而有效節約生產成本和生產周期，無疑將會產生重要的經濟效益。為了高特異性生產異戊烯醇，需要找到一種能夠高特異性水解DMAPP的焦磷酸酶，但是目前尚沒有關于焦磷酸酶底物特異性研究的報道，缺少一種能夠高特異性水解DMAPP的焦磷酸酶。Wither等鑒定了一種來源于枯草芽孢桿菌的焦磷酸酶基因，并通過體內和體外反應進行了其功能，發現其能夠水解IPP和DMAPP生成異戊烯醇和異戊二烯醇(Wither?et?al，2007)，但沒有對其底物特異性進行研究，也沒有對異戊烯醇和異戊二烯醇生產途徑進行優化。?

發明內容

為解決上述現有技術中存在的問題，本發明主要通過代謝工程改造甲羥戊酸途徑(MVA途徑)，特別是過量表達來源于大腸桿菌的焦磷酸酶，從而在工程大腸桿菌中實現了高特異性生產產物組成超過80％以上的異戊烯醇。?

因此，在第一個方面，本發明提供了一種重組大腸桿菌菌株，其包含：?

(1)編碼羥甲基戊二酰輔酶A合成酶的基因片段和編碼羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的基因片段或分別與羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因具有70％以上同源性的核酸分子；?

(2)編碼甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶和異戊烯基焦磷酸異構酶的基因片段或分別與甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶和異戊烯基焦磷酸異構酶基因具有70％以上同源性的核酸分子；?

(3)編碼焦磷酸酶的基因片段，或與焦磷酸酶基因具有70％以上同源性的核酸分子，或與焦磷酸酶基因無明顯同源性但其表達產物能夠水解異戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且對二甲基丙烯基焦磷酸具有明顯底物偏愛性的核酸分子。?

在第二個方面，本發明提供了一種制備重組大腸桿菌菌株的方法，該方法包括以下步驟：?

(1)制備包含羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因片段或與羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因具有70％以上同源性的核酸序列的重組質粒A；?

(2)將重組質粒A與羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因片段或與羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因具有70％以上同源性的核酸序列連接成重組質粒B；?