[發明專利]一種生物法合成異戊烯醇的方法

有效

• 申請號: 201210243034.4
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN103540558A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 咸漠;鄭艷寧;劉煒
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/63;C12P7/04;C12R1/19
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 紀曉峰

1.一種重組大腸桿菌菌株，其包含：

(1)編碼羥甲基戊二酰輔酶A合成酶的基因片段和編碼羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的基因片段或分別與羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因具有70％以上同源性的核酸分子；

(2)編碼甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶和異戊烯基焦磷酸異構酶的基因片段或分別與甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶和異戊烯基焦磷酸異構酶基因具有70％以上同源性的核酸分子；

(3)編碼焦磷酸酶的基因片段，或與焦磷酸酶基因具有70％以上同源性的核酸分子，或與焦磷酸酶基因無明顯同源性但其表達產物能夠水解異戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且對二甲基丙烯基焦磷酸具有明顯底物偏愛性的核酸分子。

2.一種制備重組大腸桿菌菌株的方法，該方法包括以下步驟：

(1)制備包含羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因片段或與羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因具有70％以上同源性的核酸序列的重組質粒A；

(2)將重組質粒A與羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因片段或與羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因具有70％以上同源性的核酸序列連接成重組質粒B；

(3)制備包含甲羥戊酸激酶基因片段、磷酸甲羥戊酸激酶基因片段、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因片段和異戊烯基焦磷酸異構酶基因片段或分別與甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶和異戊烯基焦磷酸異構酶基因具有70％以上同源性的核酸分子的重組質粒C；

(4)制備包含焦磷酸酶基因片段，或與焦磷酸酶基因具有70％以上同源性的核酸分子，或與焦磷酸酶基因無明顯同源性但其表達產物能夠水解異戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且對二甲基丙烯基焦磷酸具有明顯底物偏愛性的核酸分子的重組質粒D；

(5)將重組質粒B、C和D共同轉化大腸桿菌感受態細胞，通過篩選獲得含有三種重組質粒的工程重組大腸桿菌菌株。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述重組質粒B、C和D分別包含與表達調控元件可操作地連接的不同的抗生素抗性基因片段。

4.一種合成異戊烯醇的方法，該方法包括將權利要求1所述的重組大腸桿菌菌株在適宜于其生長的條件下在包含合適的碳源和誘導劑的培養基中進行培養，在培養過程中不斷通入空氣，從尾氣中分離包含異戊烯醇的產物。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的重組大腸桿菌或方法，其中所述羥甲基戊二酰輔酶A合成酶和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶分別由來源于糞腸球菌(Enterococcus?faecalis)的HMG-CoA合成酶基因mvaS和HMG-CoA還原酶基因mvaE編碼。

6.根據權利要求1-5中任一項所述的重組大腸桿菌或方法，其特征在于所述甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶和異戊烯基焦磷酸異構酶分別由來源于釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)的甲羥戊酸激酶基因ERG12，甲羥戊酸磷酸激酶基因ERG8，甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因MVD1和異戊烯基焦磷酸異構酶基因IDI1編碼。

7.根據權利要求1-6中任一項所述的重組大腸桿菌或方法，其特征在于所述焦磷酸酶由來源于大腸桿菌(Escherichia?coli)的焦磷酸酶基因EcNudF編碼，或由來源于其它生物體的與所述大腸桿菌焦磷酸酶基因同源性超過70％的核酸分子編碼，或由與大腸桿菌焦磷酸酶基因無明顯同源性但其表達產物能夠水解異戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且對二甲基丙烯基焦磷酸具有明顯底物偏愛性的核酸分子編碼。

8.根據權利要求4-7中任一項所述的方法，其特征在于所述碳源是可再生糖類，如水解生物質，包括甘蔗渣、玉米秸稈、木漿、轉化糖，以及單糖、二糖、多糖等。

9.根據權利要求1-8中任一項所述的重組大腸桿菌或方法，其特征在于所述焦磷酸酶基因在所述大腸桿菌中過量表達。

10.根據權利要求1-9中任一項所述的重組大腸桿菌或方法，其特征在于所述重組大腸桿菌是保藏號為CGMCC?No.5745的大腸桿菌菌株。