[發明專利]一種從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法

有效

• 申請號: 201210241870.9
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN103539852A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 郭頎然;楊松峰;許必雄
• 申請（專利權）人: 上海泰龍生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K14/755
• 分類號: C07K14/755;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及生物工程下游技術，尤其涉及從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法。

背景技術

凝血八因子，又稱為抗血友病因子，在內源性凝血體系中具有十分重要的作用，是激活凝血因子Ⅸ的輔助因子。基因重組因子Ⅷ(rFⅧ)即重組人凝血八因子是第1個上市的重組凝血因子制品，1992年第一個重組人凝血八因子產品Baxter公司的Recombinate獲得FDA批準，后面陸續推出了Bayer公司的Kogenate?FS，Genetics?Institute公司的ReFacto，2003年FDA批準了Baxter公司第二代產品Avate，2007年SFDA批準了首個國內上市的rFⅧ拜科奇。長達20年的臨床應用表明，重組人凝血八因子與天然凝血八因子相比具有相似的生化、免疫及藥理學特性，能有效糾正血友病患者的出血傾向，具有良好的治療效果。

重組人凝血八因子的純化是八因子制備過程中的難點，主要是八因子穩定性差，容易產生降解，從而失活。由于八因子的不穩定性，早期的第一代重組人凝血八因子產品，Recombinate，Kogenate?FS等利用有血清培養基培養，在純化中添加人血白蛋白做保護劑，防止八因子降解，第二代產品為了制備出無血清無蛋白的重組八因子產品，改進了部分純化工藝，很多文獻專利報道了在純化過程中緩沖液添加了氯化鈣，氯化鈉，組氨酸。也有一些報道添加了基礎氨基酸例如賴氨酸或者糖類例如蔗糖等，這些成分的添加都是為了維持無白蛋白保護的八因子的穩定性。美國專利4877608提到了低離子強度，歐洲專利0314095緩沖液使用了高離子強度和組氨酸，美國專利5763401提到了添加蔗糖能保護八因子活性。但是，八因子的純化在添加了這些添加物后還需要在純化過程中嚴格控制低溫的環境，才可以更好的維持八因子的穩定性。

因此，目前重組人凝血八因子的純化過程都是在低溫下進行，而且要求比較快速的處理細胞培養液，為了維持八因子的穩定，一般會在層析分離純化的緩沖液中添加鈣離子等添加物用以保護八因子，防止八因子降解，但是如果八因子在純化過程中時間比較長（超過4小時）或者溫度控制不好（超過10度），八因子會出現降解條帶，而且降解條帶很難通過層析的方法除去，所以從細胞培養液開始就維持八因子的穩定性，防止八因子的降解就成為得到合格的重組人凝血八因子產品的關鍵。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中的缺陷，提供一種重組人凝血八因子的純化方法。

本發明提供了一種從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，包括下列步驟：

1）去除重組人凝血八因子細胞培養液中的細胞；

2）將去除細胞的培養液超濾濃縮；

3）將超濾濃縮的培養液經陰離子交換層析、免疫親和層析或凝膠過濾層析中的一項或多項純化獲得純化的重組人凝血八因子；

其中，步驟3）所述陰離子交換層析、免疫親和層析及凝膠過濾層析中所采用的平衡緩沖液，以及步驟3）所述陰離子交換層析和免疫親和層析的洗脫緩沖液中，均含有摩爾濃度為1-100mM的鈣離子及摩爾濃度為1-100mM的鋅離子，鈣離子與鋅離子的摩爾濃度優選均為2-50mM，更優選均為2-20mM，最優選均為10mM。

其中，步驟3）在首次層析前，將超濾濃縮的培養液采用首次層析所用的平衡緩沖液以體積比1：2-1:50混合并再次超濾濃縮后，再進行層析。超濾濃縮的培養液與平衡緩沖液的體積比優選1:5-1:50。

所述步驟1）中，

去除重組人凝血八因子的細胞培養液中的細胞的方法為現有技術，如微孔過濾、離心去除細胞等，具體如采用0.45微米膜過濾。

所述步驟2）中，

可采用截留分子量為10-300KD的超濾膜超濾濃縮，如采用截留分子量為30KD的超濾膜超濾濃縮。

所述步驟3）中，

所述陰離子交換層析所用的層析柱可選自Q?Sepharose?FF陰離子交換層析柱、DEAE陰離子交換層析柱、Capto?Q陰離子交換層析柱中的至少一種。優選采用Q?Sepharose?FF陰離子交換層析柱和DEAE?FF陰離子交換層析柱。