[發明專利]一種從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法

有效

• 申請號: 201210241870.9
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN103539852A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 郭頎然;楊松峰;許必雄
• 申請（專利權）人: 上海泰龍生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C07K14/755
• 分類號: C07K14/755;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，包括下列步驟：

1）去除重組人凝血八因子細胞培養液中的細胞；

2）將去除細胞的培養液超濾濃縮；

3）將超濾濃縮的培養液經陰離子交換層析、免疫親和層析或凝膠過濾層析中的一項或多項純化獲得純化的重組人凝血八因子；

其中，步驟3）所述陰離子交換層析、免疫親和層析及凝膠過濾層析中所采用的平衡緩沖液，以及步驟3）所述陰離子交換層析和免疫親和層析中所采用的洗脫緩沖液中，均含有摩爾濃度為1-100mM的鈣離子及摩爾濃度為1-100mM的鋅離子。

2.如權利要求1所述從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，鈣離子的摩爾濃度及鋅離子的摩爾濃度均為2-50mM。

3.如權利要求1所述從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，步驟3）在首次層析前，將超濾濃縮的培養液采用首次層析所用的平衡緩沖液以體積比1：2-1:50混合并再次超濾濃縮后，再進行層析。

4.如權利要求1所述從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步驟1）中，采用0.45微米膜過濾去除重組人凝血八因子的細胞培養液中的細胞。

5.如權利要求1所述從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步驟2）中，采用截留分子量為10-300KD的超濾膜超濾濃縮。

6.如權利要求1所述從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步驟3）中，所述陰離子交換層析所用的層析柱選自Q?Sepharose?FF陰離子交換層析柱、DEAE陰離子交換層析柱和Capto?Q陰離子交換層析柱；所述免疫親和層析所用的層析柱為偶聯有凝血八因子抗體的親和層析柱；所述凝膠過濾層析所用的層析柱選自Superdex200HR,Sephacryl?S-300HR和Sephacryl?S-400HR。

7.如權利要求1所述從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步驟3）中，陰離子交換層析、免疫親和層析及凝膠過濾層析所用平衡緩沖液及洗脫緩沖液由Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液或HEPES緩沖液添加鈣離子源與鋅離子源獲得。

8.如權利要求1所述從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步驟3）中，陰離子交換層析所用平衡緩沖液為：含1-100mM的鈣離子，1-100mM的鋅離子，5-15mM?L-組氨酸,200-400mM?NaCl,pH6.0-8.0的平衡緩沖液；陰離子交換層析所用洗脫緩沖液為：含1-100mM的鈣離子，1-100mM的鋅離子，5-15mM?L-組氨酸,600-800mM?NaCl,pH6.0-8.0的洗脫緩沖液；免疫親和層析所用平衡緩沖液為：含1-100mM的鈣離子，1-100mM的鋅離子，5-15mM?L-組氨酸,200-400mM?NaCl,0.01-0.03%Tween?80,pH6.0-8.0的平衡緩沖液；免疫親和層析所用洗脫緩沖液為：含1-100mM的鈣離子，1-100mM的鋅離子，5-15mM?L-組氨酸,1.0-2.0M?NaCl,0.01-0.03%Tween80,40-60%乙二醇,pH5.5-7.5的洗脫緩沖液；凝膠過濾層析析所用平衡緩沖液為：含1-100mM的鈣離子，1-100mM的鋅離子，100-200mM?NaCl,1-3%蔗糖，pH5.8-7.8的10-30mM磷酸鹽緩沖液。

9.如權利要求1所述從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，所述平衡緩沖液及洗脫緩沖液中所含鈣離子的鈣離子源選自氯化鈣、硫酸鈣和碳酸鈣；所述平衡緩沖液及洗脫緩沖液中所含的鋅離子的鋅離子源選自醋酸鋅、硫酸鋅和碳酸鋅。

10.如權利要求1-9任一權利要求所述從細胞培養液中分離純化重組人凝血八因子的方法，其特征在于，步驟3）的層析純化方法具體為：將超濾濃縮的培養液進行Q?SepharoseFF陰離子交換層析并收集洗脫液；將經Q?Sepharose?FF陰離子交換層析獲得的洗脫液進行免疫親和層析并收集洗脫液；將經免疫親和層析獲得的洗脫液進行DEAE?FF陰離子交換層析并收集洗脫液；再將經DEAE?FF陰離子交換層析獲得的洗脫液進行凝膠過濾層析并收集凝膠過濾主峰，最終獲得純化的重組人凝血八因子。