[發明專利]一種隱睪特異性生精細胞模型的制備方法

有效

• 申請號: 201210241585.7
• 申請日: 2012-07-12
• 公開（公告）號: CN103540567A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 陳方;周君梅
• 申請（專利權）人: 上海市兒童醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/076
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

技術領域

本發明涉及醫學研究領域，涉及隱睪特異性生精細胞模型的制備方法。

背景技術

睪丸是男性主要性器官，其功能是產生精子，精子與卵子結合，形成新的個體。隱睪是指男嬰出生后單側或雙側睪丸末降至陰囊而停留在其正常下降通路之任何一處，是最常見的男性生殖器先天性畸形之一，近年來其發病率呈上升趨勢，其分子生物學機制至今尚未明確。隱睪患者常見的并發癥之一是成年后生育功能異常。雙側睪丸未降者如果未進行早期干預，大多數成年后都會引起男性不育；但即便對隱睪患兒進行了早期干預如雙側睪丸固定術后，仍有約19%的病例成年后發生不育，提示在此病理過程中除了陰囊提供的適宜的微環境因素之外，單獨的早期睪丸固定術不足以完全恢復隱睪患兒睪丸的生精功能,其病理過程還涉及其他的在生精過程中發揮作用的分子和遺傳學因素，而針對這些分子和遺傳學因素進行研究并尋找合適的治療靶點是探索治療隱睪性不育的重要途徑。

研究對象的局限性往往限制了研究的進展。由于倫理的限制和實驗技術的制約，以上這些發育早期和生殖相關的基因研究很難在人體上進行。細胞生物學的飛速發展有望克服這個領域的研究對象的局限性，為之提供理想的細胞模型。2007年，具有胚胎干細胞（Embryonic?stem?cells,ES細胞）樣特性的可誘導的多能干細胞(induced?pluripotent?stem?cells，iPS細胞）的出現，利用相應的疾病特異性的細胞模型研究該疾病發生和發展的分子機制及其干預措施，具有研究周期短、細胞易于培養和擴增、細胞水平上易于進行基因干擾或過表達以研究該基因的功能等優勢，正成為研究者手中的有力工具。ES細胞具有2個特性：自我更新和多向分化潛能,在相應條件下具有分化成機體三個胚層各種細胞的潛能，自建系以來除了為再生醫學提供種子細胞,利用其體外的分化過程模擬人類胚胎早期發育并對其進行研究也一直受到關注。在ES研究的基礎上，通過向體細胞中導入OCT4、SOX2、KLF4、CMYC4個轉錄因子，體細胞可被重編程為iPS細胞，其特征類似于ES細胞。人的iPS細胞的成功誘導后，建立攜帶有人類疾病的遺傳背景的疾病特異性的iPS細胞系作為研究該疾病的細胞模型，引起了生物和醫學領域的廣泛關注，是研究相應疾病的分子機制和治療方法的重要工具。

發明內容

本發明所要解決的技術問題為提供一種隱睪特異性細胞模型的制備方法。

為此，本發明提供了一種隱睪特異性生精細胞模型的制備方法，包括下列步驟：

a)收集隱睪患者新鮮尿液，離心沉淀種子細胞；

b)細胞加入種子細胞培養液，培養；

c)iPS細胞的建立和鑒定；

d)iPS細胞體外誘導分化為生精細胞。

在優選實施例中，所述種子細胞培養液為

A．Keratinocyte-SFM+supplement(BPE20ng/ml,EGF10ng/ml)+1%L-glutamine+1%P/S

B．330ml?DMEM(H-G)+110ml?F-12nutrient?mixure+50ml?FBS+5ml?L-glutamine+5ml?P/S+Hydrocortisone(0.4ug/ml)+EGF(10ug/ml)

上述A和B兩種培養液，以體積比2:1混合即為最終培養液。

在優選實施例中，所述iPS細胞的建立為通過將OCT4、SOX2、KLF4、CMYC4個轉錄因子導入種子細胞，接種在輻照后的飼養層細胞上，每天更換人胚胎干細胞培養液，將出現的集落樣生長的細胞用機械法挑出克隆，所述人胚胎干細胞培養液為DMEM/F12+20%KSR+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺+4ng/ml?bFGF。

在優選實施例中，所述iPS細胞體外誘導分化為生精細胞步驟為基礎誘導液為DMEM/F12，加20%KSR，加1%NEAA，加1Mm?L-Glutamine，第一階段誘導因子為BMP4，其作用濃度為100ng/ml，作用時間為1周；第二階段誘導因子為FGF9，其作用濃度為50ng/ml，作用時間為2周；第三階段誘導因子為RA，其作用濃度為1Um，作用時間為1周。

本發明方法具有以下突出優點和特點：一，所選種子細胞為來源于尿液的細胞，其取材方式完全無創，易于被患兒接受，對于研究兒科疾病尤為重要；二，從尿源性細胞得到的iPS細胞通過各種鑒定，證實其具有和ES細胞類似的特性，可體外誘導分化為生精細胞，為研究隱睪發病的分子機制和藥物篩選提供了實驗平臺。

附圖說明