[發(fā)明專利]一種隱睪特異性生精細胞模型的制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210241585.7 | 申請日： | 2012-07-12 |
| 公開（公告）號： | CN103540567A | 公開（公告）日： | 2014-01-29 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳方;周君梅 | 申請（專利權(quán)）人： | 上海市兒童醫(yī)院 |
| 主分類號： | C12N5/10 | 分類號： | C12N5/10;C12N5/076 |
| 代理公司： | 上海天翔知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31224 | 代理人： | 呂伴 |
| 地址： | 200040 上海*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 隱睪 特異性 精細 模型 制備 方法 | ||
1.一種隱睪特異性生精細胞模型的制備方法，包括下列步驟：
a)收集隱睪患者新鮮尿液，離心沉淀種子細胞；
b)細胞加入種子細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)；
c)iPS細胞的建立和鑒定；
d)iPS細胞體外誘導分化為生精細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述種子細胞培養(yǎng)液為
A．Keratinocyte-SFM+supplement(BPE20ng/ml,EGF10ng/ml)+1%L-glutamine+1%P/S
B．330ml?DMEM+110ml?F-12nutrient?mixure+50ml?FBS+5mlL-glutamine+5ml?P/S+0.4ug/ml?Hydrocortisone+10ug/ml?EGF上述A和B兩種培養(yǎng)液，以體積比2:1混合即為最終培養(yǎng)液。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述iPS細胞的建立為通過將OCT4、SOX2、KLF4、CMYC4個轉(zhuǎn)錄因子導入種子細胞，接種在輻照后的飼養(yǎng)層細胞上，每天更換人胚胎干細胞培養(yǎng)液，將出現(xiàn)的集落樣生長的細胞用機械法挑出克隆，所述人胚胎干細胞培養(yǎng)液為DMEM/F12+20%KSR+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺+4ng/ml?bFGF。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述iPS細胞體外誘導分化為生精細胞步驟為基礎(chǔ)誘導液為DMEM/F12，加20%KSR，加1%NEAA，加1MmL-Glutamine，第一階段誘導因子為BMP4，其作用濃度為100ng/ml，作用時間為1周；第二階段誘導因子為FGF9，其作用濃度為50ng/ml，作用時間為2周；第三階段誘導因子為RA，其作用濃度為1Um，作用時間為1周。
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