[發(fā)明專利]一種石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210240292.7
• 申請日: 2012-07-11
• 公開（公告）號: CN102727879A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 秦啟偉;歐陽征亮;魏京廣;黃曉紅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/20;C12N7/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

石斑魚肉質(zhì)鮮美蛋白含量高，是一種經(jīng)濟價值極高的食用魚類，也是我國創(chuàng)匯的優(yōu)良魚類品種。但近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化，各種病害特別是病毒性疾病頻繁爆發(fā)，造成了重大的經(jīng)濟損失。虹彩病毒是石斑魚的重要致病病原，它可以造成魚類的死亡率從30%(成魚中)到100%(幼苗階段)。這種病毒在亞洲，特別是在22℃以上的高水溫，極易感染中國、日本和東南亞等國養(yǎng)殖的海水名貴魚類，如石斑魚、尖吻鱸、真鯛、牙鲆和大黃魚等，致使魚類大面積的死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，因而被稱之為“海洋口蹄疫”。石斑魚虹彩病毒（SGIV）是從養(yǎng)殖的石斑魚中分離到的一株新的虹彩病毒，可導(dǎo)致石斑魚死亡率達90%以上，給石斑魚的養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟損失。因此，如何預(yù)防和治療虹彩病毒病已成為當(dāng)今世界上石斑魚養(yǎng)殖業(yè)急需解決的重要問題。

眾所周知，疫苗作為化學(xué)藥品和抗生素的替代品，是治療疾病、特別是病毒病的最好選擇。滅活疫苗具有較強的安全性和免疫原性。專利公開號為102178945A的專利申請，公開了一種制備石斑魚虹彩病毒β-丙內(nèi)酯滅活疫苗的方法，制備的滅活疫苗可以使赤點石斑魚獲得十分理想的免疫保護效果，相對免疫保護率在90%以上，對防治石斑魚虹彩病毒病有很高的實踐應(yīng)用價值。但是該方法只是在實驗室里制備細(xì)胞滅活疫苗，其生產(chǎn)成本高，勞動強度大，還無法在工業(yè)上大規(guī)模的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)成本低、勞動強度小，能適用于GMP條件下大規(guī)模生產(chǎn)安全有效的石斑魚虹彩病毒滅活疫苗的石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)方法。

本發(fā)明的石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)：將石斑魚脾組織細(xì)胞接入轉(zhuǎn)瓶中，加入細(xì)胞生長液，充分搖勻后置于轉(zhuǎn)瓶機上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為16~20轉(zhuǎn)/小時，所述的細(xì)胞生長液為：含體積分?jǐn)?shù)8~10%的胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.266%NaCl和5mM?HEPES的L15培養(yǎng)基；

（2）病毒的擴增和收獲：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)石斑魚脾組織細(xì)胞直至長滿單層，接種0.01MOI的石斑魚虹彩病毒于對數(shù)生長期的石斑魚脾組織細(xì)胞中，于28℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機轉(zhuǎn)速設(shè)置為16~20轉(zhuǎn)/小時，培養(yǎng)2~3小時以吸附病毒，隨后將轉(zhuǎn)瓶機轉(zhuǎn)速設(shè)為3~5轉(zhuǎn)/小時，以擴增病毒，觀察病毒病變效應(yīng)，直至細(xì)胞病變完全，然后反復(fù)凍融2~3次；

（3）將凍融后的病毒液中的病毒滅活后獲得石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。

所述的石斑魚脾組織細(xì)胞是通過以下方法培養(yǎng)的：將長滿單層的石斑魚脾組織細(xì)胞，去除原有培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）漂洗一遍后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶消化1~2分鐘，加入新的細(xì)胞生長液，吹勻后分至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于28℃進行培養(yǎng)擴增，所述的細(xì)胞生長液為含體積分?jǐn)?shù)8~10%的胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.266%NaCl和5mM?HEPES的L15培養(yǎng)基。

所述的步驟（1）具體為：取10~15個長滿單層石斑魚脾組織細(xì)胞的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，去除原有培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液漂洗一遍后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶消化1~2分鐘，加入新的細(xì)胞生長液吹勻，然后轉(zhuǎn)移至5L轉(zhuǎn)瓶中，加入新的細(xì)胞生長液至總體積500ml，充分搖勻后置于轉(zhuǎn)瓶機上培養(yǎng)，溫度控制為28℃，轉(zhuǎn)速為16~20轉(zhuǎn)/小時；所述的步驟（2）具體為待培養(yǎng)2~3天后，石斑魚脾組織細(xì)胞長滿單層，接種0.01MOI的石斑魚虹彩病毒于對數(shù)生長期的石斑魚脾組織細(xì)胞中，置于28℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機轉(zhuǎn)速設(shè)置為16~20轉(zhuǎn)/小時，培養(yǎng)2~3個小時以吸附病毒，隨后將轉(zhuǎn)瓶機轉(zhuǎn)速設(shè)為3~5轉(zhuǎn)/小時，以擴增病毒，連續(xù)培養(yǎng)4~6天后，細(xì)胞病變完全，反復(fù)凍融2-3次，所述的細(xì)胞生長液為含體積分?jǐn)?shù)8~10%的胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.266%NaCl和5mM?HEPES的L15培養(yǎng)基；所述的步驟（3）具體為將凍融后的病毒液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.4~7.6，加入β-丙內(nèi)酯，β-丙內(nèi)酯與病毒液的體積比為1：500，混勻后在4℃滅活處理16~20小時，滅活期間維持pH值在7.4~7.6之間，滅活結(jié)束后病毒液于37℃水浴水解2小時，以充分水解殘留的β-丙內(nèi)酯，由此獲得石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。

HEPES其中文名為4-羥乙基哌嗪乙磺酸，其對細(xì)胞無毒性作用，是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。