[發明專利]一種石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉瓶生產方法

有效

• 申請號: 201210240292.7
• 申請日: 2012-07-11
• 公開（公告）號: CN102727879A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 秦啟偉;歐陽征亮;魏京廣;黃曉紅
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/20;C12N7/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉瓶生產方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）細胞的轉瓶培養：將石斑魚脾組織細胞接入轉瓶中，加入細胞生長液，充分搖勻后置于轉瓶機上培養，培養溫度為28℃，轉速為16~20轉/小時，所述的細胞生長液為：含體積分數8~10%的胎牛血清、質量分數0.266%NaCl和5mM?HEPES的L15培養基；

（2）病毒的擴增和收獲：轉瓶培養石斑魚脾組織細胞直至長滿單層，接種0.01MOI的石斑魚虹彩病毒于對數生長期的石斑魚脾組織細胞中，于28℃培養，轉瓶機轉速設置為16~20轉/小時，培養2~3小時以吸附病毒，隨后將轉瓶機轉速設為3~5轉/小時，以擴增病毒，觀察病毒病變效應，直至細胞病變完全，然后反復凍融2~3次；

（3）將凍融后的病毒液中的病毒滅活后獲得石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。

2.根據權利要求1所述的石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉瓶生產方法，其特征在于，所述的石斑魚脾組織細胞是通過以下方法培養的：將長滿單層的石斑魚脾組織細胞，去除原有培養液，磷酸鹽緩沖溶液漂洗一遍后加入質量分數0.25%的胰蛋白酶消化1~2分鐘，加入新的細胞生長液，吹勻后分至細胞培養瓶中于28℃進行培養擴增，所述的細胞生長液為含體積分數8~10%的胎牛血清、質量分數0.266%NaCl和5mM?HEPES的L15培養基。

3.根據權利要求1或2所述的石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉瓶生產方法，其特征在于，所述的步驟（1）具體為：取10~15個長滿單層石斑魚脾組織細胞的75cm2細胞培養瓶，去除原有培養液，用磷酸鹽緩沖溶液漂洗一遍后加入質量分數0.25%的胰蛋白酶消化1~2分鐘，加入新的細胞生長液吹勻，然后轉移至5L轉瓶中，加入新的細胞生長液至總體積500ml，充分搖勻后置于轉瓶機上培養，溫度控制為28℃，轉速為16~20轉/小時；所述的步驟（2）具體為待培養2~3天后，石斑魚脾組織細胞長滿單層，接種0.01MOI的石斑魚虹彩病毒于對數生長期的石斑魚脾組織細胞中，置于28℃培養，轉瓶機轉速設置為16~20轉/小時，培養2~3個小時以吸附病毒，隨后將轉瓶機轉速設為3~5轉/小時，以擴增病毒，連續培養4~6天后，細胞病變完全，反復凍融2-3次，所述的細胞生長液為含體積分數8~10%的胎牛血清、質量分數0.266%NaCl和5mM?HEPES的L15培養基；所述的步驟（3）具體為將凍融后的病毒液用氫氧化鈉溶液調pH值至7.4~7.6，加入β-丙內酯，β-丙內酯與病毒液的體積比為1：500，混勻后在4℃滅活處理16~20小時，滅活期間維持pH值在7.4~7.6之間，滅活結束后病毒液于37℃水浴水解2小時，以充分水解殘留的β-丙內酯，由此獲得石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。