[發(fā)明專利]一種石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210240292.7
• 申請(qǐng)日: 2012-07-11
• 公開（公告）號(hào): CN102727879A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦啟偉;歐陽征亮;魏京廣;黃曉紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號(hào): A61K39/12
• 分類號(hào): A61K39/12;A61P31/20;C12N7/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)：將石斑魚脾組織細(xì)胞接入轉(zhuǎn)瓶中，加入細(xì)胞生長液，充分搖勻后置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為16~20轉(zhuǎn)/小時(shí)，所述的細(xì)胞生長液為：含體積分?jǐn)?shù)8~10%的胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.266%NaCl和5mM?HEPES的L15培養(yǎng)基；

（2）病毒的擴(kuò)增和收獲：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)石斑魚脾組織細(xì)胞直至長滿單層，接種0.01MOI的石斑魚虹彩病毒于對(duì)數(shù)生長期的石斑魚脾組織細(xì)胞中，于28℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為16~20轉(zhuǎn)/小時(shí)，培養(yǎng)2~3小時(shí)以吸附病毒，隨后將轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)為3~5轉(zhuǎn)/小時(shí)，以擴(kuò)增病毒，觀察病毒病變效應(yīng)，直至細(xì)胞病變完全，然后反復(fù)凍融2~3次；

（3）將凍融后的病毒液中的病毒滅活后獲得石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的石斑魚脾組織細(xì)胞是通過以下方法培養(yǎng)的：將長滿單層的石斑魚脾組織細(xì)胞，去除原有培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液漂洗一遍后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶消化1~2分鐘，加入新的細(xì)胞生長液，吹勻后分至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于28℃進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，所述的細(xì)胞生長液為含體積分?jǐn)?shù)8~10%的胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.266%NaCl和5mM?HEPES的L15培養(yǎng)基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的石斑魚虹彩病毒（SGIV）滅活疫苗的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的步驟（1）具體為：取10~15個(gè)長滿單層石斑魚脾組織細(xì)胞的75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，去除原有培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液漂洗一遍后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶消化1~2分鐘，加入新的細(xì)胞生長液吹勻，然后轉(zhuǎn)移至5L轉(zhuǎn)瓶中，加入新的細(xì)胞生長液至總體積500ml，充分搖勻后置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)，溫度控制為28℃，轉(zhuǎn)速為16~20轉(zhuǎn)/小時(shí)；所述的步驟（2）具體為待培養(yǎng)2~3天后，石斑魚脾組織細(xì)胞長滿單層，接種0.01MOI的石斑魚虹彩病毒于對(duì)數(shù)生長期的石斑魚脾組織細(xì)胞中，置于28℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為16~20轉(zhuǎn)/小時(shí)，培養(yǎng)2~3個(gè)小時(shí)以吸附病毒，隨后將轉(zhuǎn)瓶機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)為3~5轉(zhuǎn)/小時(shí)，以擴(kuò)增病毒，連續(xù)培養(yǎng)4~6天后，細(xì)胞病變完全，反復(fù)凍融2-3次，所述的細(xì)胞生長液為含體積分?jǐn)?shù)8~10%的胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.266%NaCl和5mM?HEPES的L15培養(yǎng)基；所述的步驟（3）具體為將凍融后的病毒液用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.4~7.6，加入β-丙內(nèi)酯，β-丙內(nèi)酯與病毒液的體積比為1：500，混勻后在4℃滅活處理16~20小時(shí)，滅活期間維持pH值在7.4~7.6之間，滅活結(jié)束后病毒液于37℃水浴水解2小時(shí)，以充分水解殘留的β-丙內(nèi)酯，由此獲得石斑魚虹彩病毒滅活疫苗。