[發(fā)明專利]一種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體及該雙抗裝載的CIK細(xì)胞

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210238527.9
• 申請(qǐng)日: 2012-07-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102775494A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃建華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黃建華
• 主分類號(hào): C07K16/46
• 分類號(hào): C07K16/46;C07K16/30;C07K16/28;C12N5/0783
• 代理公司: 北京元中知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11223
• 代理人: 王明霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種雙特異性抗體，具體講，涉及一種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體及該雙抗裝載的CIK細(xì)胞。

背景技術(shù)

越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤干細(xì)胞在腫瘤免疫逃逸、抵抗放、化療和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起到了至關(guān)重要作用，因此治療腫瘤需要?jiǎng)?chuàng)建有效靶向殺滅腫瘤干細(xì)胞的新策略才有可能根治腫瘤，靶向腫瘤干細(xì)胞的免疫治療在單克隆抗體和干細(xì)胞疫苗研究方面已經(jīng)開(kāi)展了積極的探索。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物非常稀少，而CD133則是目前所發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞中最常見(jiàn)的標(biāo)志物之一，在腦瘤、白血病、黑色素瘤、腎癌、大腸癌、胰腺癌、肺癌、肝癌和卵巢癌等多種腫瘤干細(xì)胞中存在，它的高表達(dá)與腫瘤病人的低生存率密切相關(guān)。

由此本發(fā)明選擇CD133作為針對(duì)CD133陽(yáng)性腫瘤干細(xì)胞治療研究的新靶點(diǎn)，構(gòu)建了靶向CD133靶點(diǎn)的抗CD3/抗CD133雙特異性抗體。

過(guò)繼免疫治療中，CIK作為新一代細(xì)胞所兼具的T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的殺瘤活性與NK細(xì)胞非MHC限制性殺瘤特征,在臨床取得了很大的進(jìn)展，但是治療效果仍然有限，其原因是CIK細(xì)胞缺乏特異性靶向殺傷作用。本發(fā)明構(gòu)建了抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝備的CIK細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的在于提出一種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體；

本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出裝備有該雙抗的CIK細(xì)胞。

為了完成本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明涉及一種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體，其特征在于，所述的雙特異性抗體含有抗CD3的單克隆抗體和抗CD133的單克隆抗體。

本發(fā)明中抗CD3/抗CD133雙特異性抗體的制備方法，包括以下步驟：

（1）將抗CD3的單克隆抗體溶解于Traut's試劑，15～25℃下作用1～2小時(shí)；用PD-10柱過(guò)濾，除去未交聯(lián)的單克隆抗體；

（2）CD133/1單克隆抗體溶于交聯(lián)劑Sulfo-SMCC，15～25℃下作用1～2小時(shí)；用PD-10柱過(guò)濾，除去未交聯(lián)的單克隆抗體；

（3）將步驟（1）步驟（2）得到的交聯(lián)后的單克隆抗體混合，1～4℃下作用12～18小時(shí)。

本發(fā)明還涉及一種抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝載的CIK細(xì)胞。

該抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝載的CIK細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

（1）CIK細(xì)胞的培養(yǎng)：

取健康外周靜脈血10ml，肝素抗凝，用生理鹽水1：1稀釋后，加至淋巴細(xì)胞分離液上層，離心收集單個(gè)核細(xì)胞，用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×10⁶個(gè)/ml，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h，然后加入rhIL-1α100U/ml、鼠抗人CD3McAb50ng/ml，rhIL-21000U/ml，每?jī)商焯砑觬hIL-21000U/ml，在培養(yǎng)第14天，檢查CD3、CD4、CD8和CD56收獲CIK細(xì)胞；

（2）CIK細(xì)胞表型的檢測(cè)：

調(diào)整培養(yǎng)0天和14天的CIK細(xì)胞濃度為5×10⁶個(gè)/ml，各取200μl加入離心管中，加入鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四標(biāo)抗體及同型對(duì)照IgG1單抗各5μl，混勻，在4℃暗室反應(yīng)20～40min后，PBS洗滌1～3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞中CD3陽(yáng)性細(xì)胞≥85%，CD3和CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞≥60%，CD3和CD56雙陽(yáng)性細(xì)胞≥20%；

（3）抗CD3/抗CD133雙特異性抗體裝載CIK細(xì)胞：

離心收集培養(yǎng)14天并經(jīng)表型檢測(cè)的CIK細(xì)胞，PBS洗滌1～3次，按1×10⁶CIK/50ng雙抗?jié)舛燃尤肟笴D3/抗CD133雙特異性抗體，混勻后室溫靜置40～80分鐘，PBS洗滌1～3次。

下面對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的解釋和說(shuō)明：