[發明專利]一種同時檢測吡蟲啉和甲基對硫磷的雙特異單克隆抗體

有效

• 申請號: 201210238321.6
• 申請日: 2012-07-11
• 公開（公告）號: CN103102415A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 劉鳳權;王利民;華修德;李剛
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N5/20;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

(一)技術領域

本發明涉及應用于同時檢測吡蟲啉和甲基對硫磷雙特異性單克隆抗體及制備方法，屬于生物技術領域。專用于農產品和農業生產環境中吡蟲啉、甲基對硫磷殘留的靈敏、快速檢測，特別適用于大批量樣品檢測。?

(二)背景技術

吡蟲啉(imidacloprid，1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亞胺)和甲基對硫磷(Parathion-methyl，O，O-二甲基-O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯)是農業生產中被廣泛使用的殺蟲劑，吡蟲啉屬于中等毒性新型煙堿類殺蟲劑，而甲基對硫磷屬于高毒有機磷酸酯類殺蟲劑。目前，對這兩種農藥在農產品中的殘留檢測采用的是氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)；對這兩種農藥殘留免疫分析方法也有相關報道，但同時針對這兩種農藥的免疫多殘留檢測方法卻仍未見報道。?

農藥多殘留免疫分析技術主要有以下三種：1.將多種半抗原偶聯到一個載體蛋白上，免疫動物獲得抗血清進行農藥多殘留分析；2.提取一系列農藥的公共結構，設計出通用半抗原，免疫動物獲得單克隆抗體用于農藥多殘留分析；3.雙特異性抗體法。第一種方法因只能夠得到多克隆抗體而使其在生產上受到一定局限；第二種方法所制備的單克隆抗體只能夠識別一類農藥，對于不同種類的農藥并不能同時檢測；而雙特異性抗體很好地解決了這個問題，雙特異性抗體因其具有兩個不同的抗原結合位點，而達到同時檢測不同種類農藥的目的。?

制備雙特異性抗體主要有以下三種方法：化學交聯法、雜交-雜交瘤技術和基因工程抗體技術。本發明利用甲基對硫磷雜交瘤細胞與受吡蟲啉免疫原免疫的BALB/C小鼠脾細胞融合的技術，制備出分泌同時抗吡蟲啉-甲基對硫磷單克隆抗體的三體雜交瘤細胞。?

(三)發明內容

技術問題本發明的目的是提供一種可用于同時檢測甲基對硫磷和吡蟲啉農藥殘留的雙特異性單克隆抗體及其制備方法。通過將分泌抗甲基對硫磷單克隆抗體的雜交瘤細胞與受吡蟲啉免疫原免疫的BALB/C小鼠脾細胞融合的策略來制備能分泌抗甲基對硫磷-吡蟲啉雙特異抗體的三體雜交瘤細胞。?

技術方案?

1.抗甲基對硫磷和吡蟲啉雙特異性單克隆抗體，是由三體雜交瘤細胞株FQ-D6產生的，為IgG2b-IgG1型，抗體輕鏈為kappa鏈。?

2.抗甲基對硫磷和吡蟲啉雙特異性單克隆抗體的制備方法，包括：?

(1)分泌抗甲基對硫磷單克隆抗體的HGPRT酶缺陷型雜交瘤細胞株篩選?

將分泌抗甲基對硫磷抗體的雜交瘤細胞株置于5ug/ml8-AG培養基中培養，在培養過程中逐漸提高培養基中8-AG濃度，最終使細胞株能適應在50ug/ml的8-AG的培養基中生長；之后利用HAT選擇性DMEM培養基進行篩選，通過細胞是否存活來鑒別細胞中的酶是否缺失，缺失條件下進行克隆并擴大培養，并將細胞凍存備用。?

(2)受吡蟲啉免疫原免疫BALB/C小鼠脾細胞的準備?

將受吡蟲啉免疫原5免，血清效價達到1∶32000以上的BALB/C小鼠加強免疫3天后，眼眶取血并制備血清，作為三體雜交瘤細胞篩選時的陽性對照；將放血后的小鼠拉頸脫臼處死，并處于75％酒精體表消毒10分鐘，隨后移入超凈工作臺內，放置于無菌培養皿內，左側腹部朝上；利用無菌手術鑷和眼科剪取出小鼠脾臟，用DMEM基礎培養基輕輕洗滌，盡可能剝去脾臟周圍的脂肪和結締組織；將脾臟置于120目的尼龍濾袋內，并放入另一個盛有DMEM基礎培養液的培養皿中；將尼龍濾袋中的脾臟扎破并不斷擠壓，使脾細胞完全釋放到DMEM基礎培養液中；將脾細胞懸液轉移到50ml離心管中，1000rpm離心10分子，棄上清，將沉淀用約30mlDMEM培養液再洗一次后懸浮，備用?

(3)細胞融合?

將脾細胞與生長狀態良好的分泌抗甲基對硫磷抗體的HGPRT酶缺陷型雜交瘤細胞株通過雜交-雜交瘤技術制備三體雜交瘤細胞。并于37℃，體積比5％二氧化碳培養箱培養，待7天后通過非競爭ELISA檢測融合孔上清篩選雜交瘤細胞。?

(4)三體雜交瘤細胞的篩選?

對融合孔細胞上清采用間接非競爭ELISA法進行初步篩選，方法為：?

用碳酸鹽包被緩沖液分別稀釋甲基對硫磷及吡蟲啉包被原，96孔酶標板中每孔加入50ul，于4℃下孵育過夜，將酶標板中包被液倒盡，并用含0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌3次；將明膠用超純水配置成1％的封閉液，96孔酶標板中每孔加入200ul，37℃孵育1.5小時，將酶標板中封閉液倒盡，并用含0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖液洗滌5次?