[發明專利]一種同時檢測吡蟲啉和甲基對硫磷的雙特異單克隆抗體

有效

• 申請號: 201210238321.6
• 申請日: 2012-07-11
• 公開（公告）號: CN103102415A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 劉鳳權;王利民;華修德;李剛
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N5/20;C12R1/91
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• 代理人: 暫無信息

1.所述雙特異性單克隆抗體，是保藏編號為CCTCC?NO：C201274的三體雜交瘤細胞株FQ-D6。

2.權利要求1所述三體雜交瘤細胞株FQ-D6所分泌的單克隆抗體，是同時檢測甲基對硫磷和吡蟲啉的雙特異性單克隆抗體，為IgG2b-IgG1型，抗體輕鏈為kappa鏈。

3.權利要求1所述三體雜交瘤細胞株FQ-D6是通過將分泌抗甲基對硫磷單克隆抗體的雜交瘤細胞和經吡蟲啉抗原免疫的BALB/C小鼠脾細胞進行融合而獲得；具體制備方法包括

(1)HGPRT酶缺陷型抗甲基對硫磷雜交瘤細胞株的篩選

將分泌抗甲基對硫磷抗體的雜交瘤細胞株置于5ug/ml?8-AG培養基中培養，在培養過程中逐漸提高培養基中8-AG濃度，最終使細胞株能適應在50ug/ml的8-AG的培養基中生長；之后利用HAT選擇性DMEM培養基進行篩選，通過細胞是否存活來鑒別細胞中的酶是否缺失，缺失條件下進行克隆并擴大培養，并將細胞凍存備用。

(2)細胞融合

利用間接非競爭ELISA檢測受吡蟲啉免疫原免疫過的BALB/C小鼠血清，取效價高者解剖獲取脾臟，將脾細胞與生長狀態良好的分泌抗甲基對硫磷抗體的HGPRT酶缺陷型雜交瘤細胞株通過雜交-雜交瘤技術制備三體雜交瘤細胞。并于37℃，體積比5％二氧化碳培養箱培養，待7天后通過非競爭ELISA檢測融合孔上清篩選雜交瘤細胞。

(3)三體雜交瘤細胞篩選

對融合孔細胞上清采用間接非競爭ELISA法進行初步篩選：甲基對硫磷和吡蟲啉兩種包被原下，有融合細胞的上清液讀數均等于或大于陰性對照讀數的2.1倍時，這樣的融合孔即為陽性孔；

為了進一步確定篩選到陽性孔所分泌抗體是同時識別甲基對硫磷和吡蟲啉的雙特異性單克隆抗體，再通過間接競爭ELISA法篩選：設定甲基對硫磷包被原包被下，不含農藥的細胞上清的讀數為B₀₁，含有甲基對硫磷農藥的細胞上清讀數為B₁₁，含有吡蟲啉農藥的細胞上清液讀數為B₁₂；吡蟲啉包被原包被下，不含農藥的細胞上清的讀數為B₀₂，含有甲基對硫磷農藥的細胞上清讀數為B₂₁，含有吡蟲啉農藥的細胞上清液讀數為B₂₂。當同時出現以下現象時：B₁₁＜B₀₁，B₁₂＝B₀₁，B₂₁＜B₀₂，B₂₂＝B₀₂，便可以認定其分泌的抗體為雙特異性單克隆抗體，并利用有限稀釋法對細胞進行亞克隆，其分泌的上清即為所制的雙特異性單克隆抗體。

4.產生權利要求1或2所述的三體雜交瘤細胞株FQ-D6于2012年7月10日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：C201274。