[發明專利]一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201210238082.4
• 申請日: 2012-07-11
• 公開（公告）號: CN103540650A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 阮承邁;孫衛華;王志剛
• 申請（專利權）人: 北京合康源生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及核酸酶檢測技術領域，特別是指一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒。

背景技術

非特異性核酸內切酶(Non-specific?Endonuclease，NE)作用是把核糖核酸(包括DNA、RNA)降解成小的核酸片段和核苷酸，在生物制品行業中有廣泛的應用。尤其在醫藥用生物制品如病毒性疫苗和基因工程蛋白產品中，是降低宿主細胞核酸殘留的重要方法，而非特異性核酸內切酶本身的去除是高質量產品生產中的必須步驟，檢測其殘留也是產品質量評價中的重要一環。非特異性核酸內切酶(NE)屬于磷酸二酯酶系列，能水解核酸(包括DNA、RNA)中非特定位點的的3’-5’磷酸二酯鍵，產物是3’核苷酸或寡核苷酸。常用的是來自于粘質沙雷氏菌(Serratia?marcescens)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocal?aureus)的非特異性核酸內切酶，以及核酸酶P1(來自于桔青霉，Penicillium?citrinum)等。非特異性核酸內切酶在工業中應用主要為1、(脫氧)核苷酸生產；2、生物制品中核酸殘留的去除；前者應用中核酸降解獲得的5’一核苷酸和5’一脫氧核苷酸可加工成各種醫用藥品、生化試劑、助鮮劑以及農作物促生長劑，它廣泛應用于生物工程、醫藥、食品、化妝品、農業生產和科研等領域，并具有很高的經濟價值。在生物制品中宿主細胞的核酸殘留控制是純化工藝的難點，尤其是病毒性疫苗抗原的生產中很難去除。采用非特異性核酸內切酶是去除殘留核酸的有效方法。

目前采用的方法為兩類：1、定性檢測方法，主要是通過在一定的反應體系中加入NE和鮭魚精DNA，反應在預定時間中止，設定陰性對照和陽性對照。然后用瓊脂糖電泳觀察DNA的片段分布，通常陽性樣本中根據酶活性不同，鮭魚精DNA會降解成在200bp～數kbp范圍的涂抹條帶，或約100～200bp大小的片段，或者基本降解后沒有可見條帶。該方法的優點是直觀、可靠，可以知道底物的水解程度，缺點是無法對酶活性進行定量分析；2定量檢測方法，典型的定量檢測方法，是通過在一定的反應體系中加入NE和鮭魚精DNA，反應在預定時間加酸(高氯酸)中止，設定陰性對照和陽性對照。然后高速離心(12000×g)沉淀酸不可溶的DNA，以UV分析A_260nm，通常1OD相當于1個單位。該方法是NE類酶活性定義的基本方法，其缺點是不能進行微量分析，必須事先知道所分析的酶種類。分析時間較長，通常為2～4h。

發明內容

鑒于以上現有技術中存在的問題，本發明提出一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，解決了現有技術中無法同時對酶活性進行定量和微量分析的技術問題。

本發明的技術方案是這樣實現的：

一種疫苗中非特異性核酸內切酶活性檢測試劑盒，該試劑盒包括：

NE反應體系和熒光探針；

或NE反應體系和熒光染料。

作為優選的技術方案，所述的試劑盒還包括連續記錄熒光信號的儀器。

作為優選的技術方案，所述的試劑盒還包括定量PCR儀或熒光檢測儀。

作為優選的技術方案，所述的NE反應體系為通用反應緩沖液或系列反應緩沖液；所述的通用反應緩沖液是可同時應用于各酶的溶液，其成分包括Tris·HCl，濃度為10-100mM，優選為20-50mM；pH范圍為5～9.5，優選為5.4～8.5；還含有Ca²⁺、Zn²⁺或Mg²⁺，濃度為1mM-20mM，優選為2-10mM；如果采用熒光染料，需事先加入DNA標準品，如鮭魚精DNA或合成的隨機引物，用量為1-500ng/μl；所述系列反應緩沖液指分別針對單一酶設計的緩沖液組分，每組2-5種，其區別在于設計不同的pH值，使同一樣品在不同pH值下測定活性比，對照標準品獲得酶種類信息。

作為優選的技術方案，所述的熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團；探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；NE反應時，酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每切開一個探針鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與酶作用產物形成同步。