[發明專利]一種基因工程細胞及其在NK細胞擴增中的應用有效

申請號：	201210237023.5	申請日：	2012-07-10
公開（公告）號：	CN102911918A	公開（公告）日：	2013-02-06
發明（設計）人：	朱詩國;王艷麗	申請（專利權）人：	上海交通大學醫學院
主分類號：	C12N5/10	分類號：	C12N5/10;C12N5/0783
代理公司：	上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218	代理人：	翟羽;施春花
地址：	200025 ***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種基因工程細胞及其 nk 擴增中的應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及疾病免疫治療，尤其涉及NK細胞免疫治療中NK細胞的體外制備。

背景技術

NK細胞（natural?killer?cell，自然殺傷細胞）是一類大顆粒淋巴細胞，是機體固有免疫和適應性免疫的重要橋梁，在機體抗感染性疾病和惡性腫瘤免疫監視過程中發揮重要作用。繼發性NK細胞移植能產生良好的抗腫瘤效應，而其自身很少被受體排斥，且不會引起任何GVHD（Graft?Versus?Host?Disease）。因此，繼發性NK細胞治療（Adoptive?NK?cell?therapy）已成為目前最熱門和最有前途的惡性腫瘤治療方法之一。

盡管繼發性NK細胞免疫治療具有良好的抗腫瘤效應和巨大的應用前景，但NK細胞免疫治療仍然難以進行常規臨床應用，其中最主要障礙在于，在外周血單核細胞（PBMC）中，NK細胞只是一個很小的群體，僅占人外周血單核細胞的10～15%，難以滿足巨大的臨床需要。為解決這一難題，首先要在數量上保證NK細胞的有效供給。因此，探索各種有效的NK細胞體外擴增（Ex?vivo?expansion）方法已成為NK細胞免疫治療的必然趨勢。

應用基因工程細胞（?Gene?engineering?cells,?GEC）作為飼養細胞（feeder?cell）進行NK細胞體外擴增是一種重要的NK細胞擴增新策略。在以往的研究中有研究者應用CD64、CD86修飾K562細胞構建人工抗原遞呈細胞(Antigen?present?cell,?aAPC)，然后將4-1BBL（CD137L）和膜固定IL15（membrane-bound?IL-15,?mIL-15）等導入此細胞中，構建CD64-CD86-4-1BBL-mIL15-aAPC，并利用此人工抗原遞呈細胞進行NK細胞體外擴增，這種方法可以獲得較強細胞毒性的NK細胞，但NK細胞增殖受到限制，5-6周后細胞不再擴增。本發明中，我們通過基因工程技術將4-1BBL和膜固定IL21（mbIL-21）直接修飾到K562細胞表面，構建4-1BBL-mbIL-21-GEC。與以往的人工抗原遞呈細胞相比，本發明更加簡單和易于操作。研究表明，4-1BBL-mbIL-21-GEC可以誘導產生大規模功能性的NK細胞，在NK細胞免疫治療臨床應用和科學研究中具有重大應用價值。

發明內容

本發明的目的是，提供一種基因工程細胞。

本發明的第二個目的是，提供一種基因工程細胞的制備方法。

本發明的第三個目的是，提供一種基因工程細胞在NK細胞擴增中的應用。

本發明的第四個目的是，提供一種NK細胞擴增方法。

為了解決本發明第一個目的，本發明提供了一種基因工程細胞，所述基因工程細胞為4-1BBL-mbIL-21-GEC，其細胞膜表面穩定表達4-1BB配體和膜固定白介素21（mbIL-21）。

作為一個優選，所述基因工程細胞為4-1BBL-mbIL-21-K562細胞。

為了解決本發明第二個目的，本發明提供了基因工程細胞的制備方法，包括以下步驟：

（1）構建4-1BBL表達的轉座子；

（2）4-1BBL轉座子與轉座酶SB11共轉染相應細胞，流式細胞分選，獲得4-1BBL穩定表達細胞4-1BBL-GEC；

（3）在步驟（2）獲得的4-1BBL-GEC?基礎上導入在細胞膜表面穩定表達的IL-21（membrane-bound?IL-21,?mbIL-21），建立4-1BBL-mbIL-21?-GEC。

作為一個優選，所述基因工程細胞為4-1BBL-mbIL-21-K562細胞。