[發明專利]黃柄鵝膏與共生植物室內共生關系的建立方法

有效

• 申請號: 201210236992.9
• 申請日: 2012-07-10
• 公開（公告）號: CN102715089A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 李宗菊;張曦予;何雋;李彪;周文;吳鵬;趙昱;馮遼遼
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G7/06;A01G1/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種黃柄鵝膏與共生植物滇青岡室內共生關系的建立方法，其特征為，利用黃柄鵝膏（Amanita?flavipes）子實體誘導菌絲體，對菌絲體進行擴繁；利用野外采集的滇青岡(Cyclobalanopsis?glaucoides?)種子培養無菌苗及盆栽苗，將已擴繁的菌絲體分別接種到無菌苗及盆栽苗根部，室內建立共生關系，主要包括下列步驟：

（1）黃柄鵝膏菌絲體的誘導及培養：野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0.08～0.16cm²的小塊；將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基表面，培養溫度為22～23℃，暗培養14～18天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，53～60天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將以上誘導的菌絲轉入培養皿中，用擴大培養基進行擴大培養；

（2）滇青岡無菌苗的培養：于云南武定獅子山闊葉林中采集滇青岡種子；將種子放至清水中，洗凈泥沙及污物，清除漂浮在水面上的爛種；將選出的種子自然干燥，把種皮剔除，挑選子葉中無明顯菌斑的種子；將挑選后的種子放置于75%乙醇溶液中，搖晃浸泡30?s，取出種子，用無菌水清洗3次；將種子放置于0.1%?HgCl₂溶液中，搖晃浸泡10?min，取出種子，用無菌水清洗6～8次；將處理后的種子放置于無菌濾紙上濾干水分；將種子芽胚朝上接進萌發培養基，每瓶接種1顆，未污染的褐化種子于21～22℃下暗培養8～10天后生根開始萌發，轉入2000～2500Lux的光照下相同溫度再培養5～8天，長出1.8～2.3cm高的小苗時進行菌絲接種；?

（3）滇青岡盆栽苗的培養：將野外取回的生境土及腐葉在陽光下曝曬2～3天，放置于花盆中；將以上濾紙濾干水分的消毒種子埋入花盆中，種植深度約3～4cm，澆水至透；每三天澆一次水，若土表過干隔天澆水；上午9：00以后將花盆置于室外自然光照下，晚上7：00左右將其移至室內保溫；約25～30天種子發芽，待59～63天小苗長至4～5片真葉、高4～6cm時進行接種。

2.根據權利要求1所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青岡室內共生關系的建立方法，其特征在于步驟（1）中的誘導培養基為：馬鈴薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、NH₄NO₃?0.30～0.40g/L、谷氨酸?0.28～0.32?g/L、V_B1?0.10mg/L、麥芽汁?150?ml/L、瓊脂11.00g/L，控制PH值為5.4左右；擴大培養基為：馬鈴薯100.00～120.00g/L、葡萄糖9.00～12.00g/L、滇青岡腐葉干粉（過80～100目分樣篩）30.00～50.00g/L、生境土干粉（過80～100目分樣篩）60.00～80.00g/L、蛋白胨?3.00～5.00?g?/L、NH₄NO₃?0.60～0.80g/L、6-BA1.20～1.50mg/L、麥芽汁200～230?ml/L、瓊脂6.00～8.00?g/L，控制PH值為5.4左右。

3.根據權利要求1所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青岡室內共生關系的建立方法，其特征在于步驟（2）中的滇青岡種子萌發培養基為：MS培養基，無糖，6-BA?1.00～1.50mg/L，NAA?0.08?～0.10mg/L，瓊脂?7.50?g/L，pH為6.80。

4.根據權利要求1所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青岡室內共生關系的建立方法，其特征在于步驟（2）中的菌絲體接種方法為：將前面培養皿中擴繁的菌絲體用1?cm直徑的打孔器截取，將截取的6個菌絲塊圍繞培養瓶中的無菌小苗按6個方向等距接種，接種瓶苗于22～23℃下培養13～16天，菌絲長滿培養瓶，小苗高3.0～3.5cm，葉3～5片，總體上接種小苗比未接種小苗，莖桿粗狀、葉色濃綠、葉片多（未接種小苗形成8.0～9.0cm的高莖桿小苗，莖長葉少），表明建立了黃柄鵝膏菌絲與無菌小苗的共生關系。

5.?根據權利要求1所述的黃柄鵝膏與共生植物滇青岡室內共生關系的建立方法，其特征在于步驟（3）中的菌絲體接種方法為：將前面培養皿中擴繁的菌絲體用1?cm直徑的打孔器截取，將花盆中的土輕輕翻開露出根部，將截取的菌絲塊圍繞根部接種（每苗接種10～15塊），蓋上泥土及腐葉，置于室外光照較好、空氣清潔處培養，每隔13～15天，接種一次，共接種五次，118～122天，植株高10.0～13.0cm，葉子9～11片，接種小苗比未接種小苗，植株及根系生長健壯，葉數多，葉子濃綠，抗病性增強，表明建立了黃柄鵝膏菌絲與盆栽小苗的共生關系。