[發(fā)明專利]一種微生物產(chǎn)γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210235889.2
• 申請日: 2012-07-10
• 公開（公告）號: CN102719367A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 肖文軍;張玥;龔志華
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N9/00;C12P13/04;C12R1/645
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 何為;袁穎華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus?pararoseus）T-C2，尤其涉及利用該微生物發(fā)酵生產(chǎn)的γ-谷氨基甲酰胺合成酶來催化合成L-茶氨酸的方法。

背景技術(shù)

L-茶氨酸（L-Theanine）是茶樹中特有的非蛋白質(zhì)游離氨基酸，它是茶葉中主要的品質(zhì)與功能成分之一，因其具有安神鎮(zhèn)靜、免疫調(diào)節(jié)等多種生理作用而廣泛應(yīng)用于食品、藥品及飼料添加劑等領(lǐng)域，并于2002年被美國健康食品行業(yè)評為最具潛力的天然產(chǎn)物之一。

L-茶氨酸的天然來源途徑極少，茶樹體內(nèi)的L-茶氨酸是以谷氨酸和乙胺為底物，在茶氨酸合成酶的作用下形成的，它與茶樹氮代謝有密切關(guān)聯(lián)。目前其制備主要包括從茶葉中直接分離純化、化學(xué)合成和生物合成等幾種方法：

（1）分離純化：由于茶葉中還存在其他較高濃度的可溶性物質(zhì)，如咖啡因和茶多酚等，那么針對現(xiàn)階段的研究，最為關(guān)鍵的難點(diǎn)在于如何分離純化得到高純度L-茶氨酸。

（2）化學(xué)合成：茶氨酸化學(xué)合成提供了一種簡單、方便、廉價的生產(chǎn)方法。但是化學(xué)合成會產(chǎn)生較多副產(chǎn)物，而且得到的產(chǎn)物是L-構(gòu)型與D-構(gòu)型的消旋體，同時反應(yīng)時間較長、污染大，經(jīng)濟(jì)效益不夠理想。

（3）生物合成：從產(chǎn)品加工成本、產(chǎn)品安全性以及產(chǎn)品質(zhì)量等方面考慮，生物合成是制備L-茶氨酸的發(fā)展趨勢。目前，國內(nèi)外L-茶氨酸生物合成主要包括茶樹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、茶樹愈傷組織培養(yǎng)、及微生物酶促合成等方法。現(xiàn)在國外L-茶氨酸生物合成主要采用微生物酶促合成法生產(chǎn)。

合成L-茶氨酸的微生物酶的研究主要集中于谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶和γ-谷氨基甲酰胺合成酶四種。上述四種微生物酶均具有γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移功能，即在適宜條件下皆能將谷氨酰基轉(zhuǎn)移給乙胺而合成L-茶氨酸，但合成機(jī)制有所不同。其中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶合成途徑須以谷氨酰胺和乙胺為底物，而其他三種則可以谷氨酸和乙胺為底物，偶聯(lián)酵母發(fā)酵作為ATP產(chǎn)生系統(tǒng)，就能合成L-茶氨酸。由于谷氨酰胺市價過高，且相比谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶，γ-谷氨基甲酰胺合成酶對乙胺具有較高的親和力，反應(yīng)中不產(chǎn)生副產(chǎn)物谷氨酰胺，使得其成為L-茶氨酸酶促合成的主要研究方向。

由此可見，就目前L-茶氨酸的市場關(guān)注度和需求量而言，尋找一種能夠生產(chǎn)合成L-茶氨酸的微生物γ-谷氨基甲酰胺合成酶，并建立γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法對其產(chǎn)業(yè)的未來發(fā)展具有重要的理論意義和實(shí)踐價值。然而，因受到研究方法與技術(shù)手段的限制，對γ-谷氨基甲酰胺合成酶的酶源篩選、培養(yǎng)與固定化及其酶促合成L-茶氨酸等關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)，國內(nèi)外目前尚未取得突破性進(jìn)展。因此，開展微生物產(chǎn)γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的研究已成為當(dāng)前L-茶氨酸制備的熱點(diǎn)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus?pararoseus）T-C2，同時還提供利用該近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus?pararoseus）T-C2發(fā)酵生產(chǎn)的γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法。

本發(fā)明的近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus?pararoseus）T-C2，已于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO：M2012232，保藏地址：中國，武漢，武漢大學(xué)。

本發(fā)明菌株近玫色鎖擲孢酵母T-C2，菌落呈玫粉色，形態(tài)呈卵圓形凸起，不透明，表面光滑，邊緣平整，菌體粘稠，易挑起，菌體多呈橢圓形或球桿狀有鎖狀聯(lián)合，年幼的菌落中可生出茁芽；經(jīng)生化檢測發(fā)現(xiàn)，糖發(fā)酵、硝酸鹽還原和類淀粉物質(zhì)的生成試驗(yàn)均呈陰性，脲酶試驗(yàn)呈陽性；經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，獲得555?bp序列，BLAST比對分析表明，該菌株與近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus?pararoseus）最為接近。

參照《真菌鑒定手冊》、中國真菌志及酵母菌各屬檢索表，按J·Lodder?酵母分類學(xué)鑒定進(jìn)行分析，由檢索表將其歸為近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus?pararoseus）。