[發明專利]一種微生物產γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法

有效

• 申請號: 201210235889.2
• 申請日: 2012-07-10
• 公開（公告）號: CN102719367A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 肖文軍;張玥;龔志華
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N9/00;C12P13/04;C12R1/645
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 何為;袁穎華

1.一種產γ-谷氨基甲酰胺合成酶的菌株，該菌株為近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus?pararoseus）T-C2，已于2012年6月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2012232。

2.權利要求1所述的菌株在制備γ-谷氨基甲酰胺合成酶中的應用。

3.一種發酵法制備γ-谷氨基甲酰胺合成酶發酵液的方法，其特征在于：發酵所用菌株為權利要求1所述的菌株，發酵所用培養基為富集培養基，發酵條件為：接種量為5-10%，溫度為28-30℃，轉速為120-180r/min，振蕩培養2-4天。

4.如權利要求3所述的發酵法制備γ-谷氨基甲酰胺合成酶發酵液的方法，其特征在于：所述富集培養基的組成為：0.25%甲胺鹽酸鹽、0.25?%甲醇、0.2?%?NaCl、0.1?%?KCl、0.03?%?MgSO₄·7H₂O、0.005?%?KH₂PO₄、0.005?%?K₂HPO₄?、1×10^﹣7?%?VB₁₂及0.03?%?酵母粉，pH7.0-7.4。

5.如權利要求3或4所述方法得到的γ-谷氨基甲酰胺合成酶發酵液。

6.由權利要求5所述的發酵液制得的γ-谷氨基甲酰胺合成酶粗酶液。

7.如權利要求6所述的γ-谷氨基甲酰胺合成酶粗酶液，其特征在于：該粗酶液是將發酵液于4℃、12000?r/min離心15-20min，棄去上清，用10?mmol/L?pH?6.0的磷酸鹽緩沖液浸洗兩次后，再于4℃、12000?r/min離心15-20min，棄去上清，然后將得到的細胞重懸于少量緩沖液中，緩沖液沒住細胞即可，再于冰上用20?kHZ的超聲波進行細胞破碎2-3min，即可。

8.利用權利要求6或7所述的γ-谷氨基甲酰胺合成酶粗酶液純化得到γ-谷氨基甲酰胺合成酶的方法，其特征在于：該方法是將所述粗酶液調節pH值為8-9，在30℃條件下加入30-35%飽和度的硫酸銨進行鹽析，用蛋白沉淀重溶液重溶至原始體積，再超濾脫鹽后，采用SephadexG-75柱層析得到。

9.利用權利要求8所述的純化的γ-谷氨基甲酰胺合成酶合成L-茶氨酸的方法，其特征在于：該方法是將上述純化得到的γ-谷氨基甲酰胺合成酶按每升L-茶氨酸合成體系加0.01-0.02mLγ-谷氨基甲酰胺合成酶的比例加入到裝有L-茶氨酸合成體系的試管中反應，在30-35℃、pH值為8-9的條件下反應10-12h后，將試管浸入沸水中終止反應，冷卻至室溫后，12000?r/min離心4-6min，取上清，得到L-茶氨酸。

10.如權利要求9所述的合成L-茶氨酸的方法，其特征在于：所述L-茶氨酸合成體系為：30?mmol/L?谷氨酸、150?mmol/L?乙胺鹽酸鹽、15?mmol/L?ATP、30?mmol/L?MgCl₂、pH7.75的100?mmol/L咪唑緩沖液、及0.1mg/mL?CTAB。