[發明專利]一種低分子肝素的離子對反相色譜質譜聯用檢測方法

有效

• 申請號: 201210235395.4
• 申請日: 2012-07-09
• 公開（公告）號: CN102759596A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 遲連利;李道遠;王章杰
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 王緒銀

技術領域

本發明涉及一種低分子肝素的離子對反相色譜與高分辨質譜聯用檢測方法，屬于藥物、原料藥、原料檢測技術領域。

背景技術

肝素是一種糖胺聚糖類藥物，具有強抗凝作用，是治療血栓栓塞性疾病的首選藥物。低分子肝素是肝素經化學方法或者酶法降解制備而成，常見的有依諾肝素鈉（Enoxaparin）、那屈肝素鈣（Nadroparin）和達肝素鈉（Dalteparin）等。與肝素相比，低分子肝素抗血栓活性較高、抗凝活性較低，具有出血副作用小、生物利用度高、體內半衰期長等優勢，受到越來越廣泛的關注和應用。

由于肝素及低分子肝素具有強極性、不均一性、硫酸基團不穩定等特點，其結構表征十分困難。通常分析低分子肝素的方法有凝膠電泳（Cowman?M?K,et?al.Biochemical?Journal,1984,221(3):707-716.）及HPSEC法（Ahsan?A,et?al.Journal?of?Pharmaceutical?Sciences,1995,84(6):724-727.），但通過這些方法僅能獲得非常粗略的分子量信息。用肝素酶將低分子肝素降解成肝素二糖，然后用離子對反相色譜與質譜聯用技術分析二糖組成是近年來比較常用的表征方法（Zhang?F,et?al.Analytical?and?Bioanalytical?Chemistry，2011,401(9):2793-2803.），但由于檢測樣品為降解后的肝素二糖，導致該方法不能鑒定未經破壞的完整低分子肝素糖鏈的結構。

除以上提及的方法外，美國藥典、歐洲藥典和中國藥典規定的低分子肝素的檢測方法也都是分析低分子肝素混合物，只能對混合物進行表征，而不能對其中的各單一組分進行直接的分析。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種低分子肝素的離子對反相色譜與高分辨質譜聯用檢測方法，可用于全譜圖鑒定低分子肝素原料藥和注射劑中主要肝素糖鏈的結構。

發明概述

本發明利用離子對反相色譜與高分辨質譜進行聯用檢測低分子肝素的各個組分，通過離子對反相色譜分離樣品中各主要組分，并通過高分辨質譜獲得精確的分子量，計算出其糖鏈序列信息，包括兩端結構、糖鏈長度、乙酰基及硫酸基取代數量，從而對低分子肝素的結構進行比較精細的表征。

發明詳述

一種低分子肝素的離子對反相色譜質譜聯用檢測方法，步驟如下：

（1）將胺類離子對試劑溶解于去離子水，用pH調節試劑調pH值至5.5～8.5，制得濃度為10～30mM的流動相A；本步驟中所述濃度是指胺類離子對試劑中溶質在流動相A中的摩爾濃度；

（2）將胺類離子對試劑溶解于體積百分比為75%的乙腈或體積百分比為75%甲醇溶液，用pH調節試劑調pH值至5.5～8.5，制得濃度為10～30mM的流動相B；本步驟中所述濃度是指胺類離子對試劑中溶質在流動相B中的摩爾濃度；

（3）將待測低分子肝素樣品溶于流動相A，配制成濃度為6～10mg/mL的待測溶液，經過濾后，使用C₁₈反相色譜柱；在流速8～12μL/min，洗脫梯度為：0～5min，80%流動相A，20%流動相B；5～65min，40～80%流動相A，20～60%流動相B，檢測器波長為232nm的條件下進行檢測，得到紫外檢測色譜圖；

（4）然后，通過在正離子模式或負離子模式下用高分辨質譜儀進行檢測，得到高分辨質譜圖；

（5）通過紫外檢測色譜圖確定低分子肝素的種類，然后根據步驟（4）獲得的高分辨質譜圖獲得主要峰的質荷比M，經如下公式計算組分的精確分子量m：

正離子模式：m=zM-nX-zY

負離子模式：m=zM-nX+zY

其中：z表示電荷數，n表示離子對試劑分子個數，X表示離子對試劑的分子量，Y表示質子氫的分子量；

（6）然后使用計算機輔助方法進行解譜，具體過程為：通過計算機生成各肝素組分的分子量數據庫，數據庫變量為肝素鏈長度、乙酰基及硫酸基取代數量，用步驟（5）中得到的精確分子量與數據庫中的理論分子量進行比對獲得誤差值I，按誤差值I的大小對數據庫中的數據進行排列，然后，根據質譜儀檢測標準品的誤差值II與誤差值I進行比對，選取誤差值II與誤差值I最為接近的數據庫中的理論樣品，通過該理論樣品的信息即可獲知待測低分子肝素樣品的低分子肝素種類、肝素糖鏈長度、乙酰基及硫酸基取代數量信息。

所述步驟（1）中的胺類離子對試劑選自：正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺、正己胺。