[發明專利]一種低分子肝素的離子對反相色譜質譜聯用檢測方法

有效

• 申請號: 201210235395.4
• 申請日: 2012-07-09
• 公開（公告）號: CN102759596A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 遲連利;李道遠;王章杰
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 王緒銀

1.一種低分子肝素的離子對反相色譜質譜聯用檢測方法，其特征在于，步驟如下：

（1）將胺類離子對試劑溶解于去離子水，用pH調節試劑調pH值至5.5～8.5，制得濃度為10～30mM的流動相A；

（2）將胺類離子對試劑溶解于體積百分比為75%的乙腈或體積百分比為75%甲醇溶液，用pH調節試劑調pH值至5.5～8.5，制得濃度為10～30mM的流動相B；

（3）將待測低分子肝素樣品溶于流動相A，配制成濃度為6～10mg/mL的待測溶液，經過濾后，使用C₁₈反相色譜柱；在流速8～12μL/min，洗脫梯度為：0～5min，80%流動相A，20%流動相B；5～65min，40～80%流動相A，20～60%流動相B，檢測器波長為232nm的條件下進行檢測，得到紫外檢測色譜圖；

（4）然后，通過在正離子模式或負離子模式下用高分辨質譜儀進行檢測，得到高分辨質譜圖；

（5）通過紫外檢測色譜圖確定低分子肝素的種類，然后根據步驟（4）獲得的高分辨質譜圖獲得主要峰的質荷比M，經如下公式計算組分的精確分子量m：

正離子模式：m=zM-nX-zY

負離子模式：m=zM-nX+zY

其中：z表示電荷數，n表示離子對試劑分子個數，X表示離子對試劑的分子量，Y表示質子氫的分子量；

（6）然后使用計算機輔助方法進行解譜，具體過程為：通過計算機生成各肝素組分的分子量數據庫，數據庫變量為肝素鏈長度、乙酰基及硫酸基取代數量，用步驟（5）中得到的精確分子量與數據庫中的理論分子量進行比對獲得誤差值I，按誤差值I的大小對數據庫中的數據進行排列，然后，根據質譜儀檢測標準品的誤差值II與誤差值I進行比對，選取誤差值II與誤差值I最為接近的數據庫中的理論樣品，通過該理論樣品的信息即可獲知待測低分子肝素樣品的低分子肝素種類、肝素糖鏈長度、乙酰基及硫酸基取代數量信息。

2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟（1）中的胺類離子對試劑選自：正丙胺、三正丙胺、正戊胺、正丁胺、正己胺。

3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟（1）中的pH調節試劑為：六氟異丙醇、甲酸。

4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟（4）中的高分辨質譜采用離子阱時間飛行串聯質譜儀，設定參數為：正離子模式噴霧電壓：+3.6kV；負離子模式噴霧電壓：-3.0kV；噴霧氣流速：1.5L/min；掃描質量范圍：50～5000。

5.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟（4）中的高分辨質譜采用四級桿時間飛行串聯質譜儀，設定參數為：正離子模式噴霧電壓：+5.5kV；負離子模式噴霧電壓：-4.0kV；簾氣壓25psi；噴霧氣壓：30psi；掃描質量范圍：50～4000。?