[發(fā)明專(zhuān)利]甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體均相發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210235362.X
• 申請(qǐng)日: 2012-07-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102735833A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李會(huì)強(qiáng);孫穎;張明華;王高升;單立新;苑鳳君;薛寒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 沃克（天津）生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/543
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 天津市宗欣專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 12103
• 代理人: 董光仁

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及光激發(fā)偶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，具體為甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體均相發(fā)光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

甲狀腺過(guò)氧化物酶（TPO）是一種含有血紅素輔基的膜結(jié)合糖蛋白，整個(gè)分子分為膜內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和膜外區(qū)，伸向充滿(mǎn)膠質(zhì)濾泡腔的部分具有催化活性。TPO作為甲狀腺激素合成過(guò)程中一種重要的酶，能催化碘的活化、甲狀腺球蛋白上酪氨酸殘基的碘化及碘化酪氨酸殘基的偶聯(lián)，最終生成甲狀腺素（T₃、T₄）。當(dāng)甲狀腺發(fā)生病變，濾泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞時(shí)，TPO于甲狀腺濾泡細(xì)胞腔的邊緣即甲狀腺細(xì)胞頂部向外周血溢漏，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生TPO抗體（anti-TPO抗體）。TPO抗體可通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)引起甲狀腺細(xì)胞損傷。因此，血清TPO抗體定量分析可用于自身免疫性甲狀腺疾病的診斷、預(yù)測(cè)疾病發(fā)展等方面。?

目前有3種試劑用于TPO抗體的定量分析：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、酶促發(fā)光免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析。①酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以酶標(biāo)反應(yīng)板為固相載體，采用傳統(tǒng)間接反應(yīng)模式：將已知抗原（TPO）吸附在固相載體上，加待測(cè)抗體,?再加酶（如辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記抗人IgG，最終形成抗原－待測(cè)抗體－酶標(biāo)記抗體復(fù)合物；加入酶顯色底物（如四甲基聯(lián)苯胺），借助酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，待測(cè)抗體的含量與吸光度值呈正比。②酶促發(fā)光免疫分析測(cè)定原理基本同酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。但有兩點(diǎn)不同：其一采用微球作為固相載體；其二采用酶的發(fā)光底物。以美國(guó)德普公司（DPC）生產(chǎn)的TPO抗體試劑為例，采用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG作為標(biāo)記抗體，使用金鋼烷-?1?,2?-二氧乙烷衍生物?(AMPPD)作發(fā)光底物。在堿性磷酸酶的作用下，AMPPD迅速脫去磷酸基團(tuán)，生成不穩(wěn)定的中間體AMPD，AMPD很快自行分解，從高能激發(fā)態(tài)回到低能穩(wěn)定態(tài)時(shí)發(fā)出光子。這種化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)，容易測(cè)定，也容易控制。③電化學(xué)發(fā)光免疫分析采用三聯(lián)吡啶釕或其衍生物NHS作為標(biāo)記物。以羅氏公司生產(chǎn)的TPO抗體試劑為例，此方法以磁微粒作為固相載體包被鏈霉親和素，用生物素標(biāo)記TPO抗原，在反應(yīng)體系內(nèi)標(biāo)記了三聯(lián)吡啶釕的羊抗人TPO抗體與待測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合生物素化抗原，形成磁性微粒包被鏈霉親和素-生物素化抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記羊抗人TPO抗體復(fù)合物，將復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引入三丙胺（TPA）緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗原和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測(cè)抗體的濃度呈反比。患者血樣中的TPOAb含量與系統(tǒng)所檢測(cè)的相對(duì)光單位(RLUs)數(shù)量呈正比關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可以算出患者血樣中的TPOAb濃度。?

酶免疫分析檢測(cè)甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體的主要優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在：檢測(cè)試劑已實(shí)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)化、酶標(biāo)儀普及程度高；因此，酶免疫分析具有較低檢測(cè)成本，能夠在基層醫(yī)院開(kāi)展工作。但是，由于采用酶作為示蹤物質(zhì)，穩(wěn)定性較差且酶活性干擾因素較多，導(dǎo)致酶免疫分析的精密度不夠理想。此外，酶免疫分析采用微孔反應(yīng)版作為固相材料，微孔內(nèi)用于包被抗體面積有限，不能包被足夠的抗體，不能實(shí)現(xiàn)理想檢測(cè)范圍。化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前檢測(cè)性能較高標(biāo)記免疫分析技術(shù)，具有較高的自動(dòng)化水平，較高的檢測(cè)性能（敏感度、精密度、穩(wěn)定性等方面）。但是，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀比較昂貴，且檢測(cè)試劑依賴(lài)進(jìn)口，從而使檢測(cè)成本很高，基礎(chǔ)醫(yī)療單位很難開(kāi)展。?

此外，現(xiàn)有TPO抗體檢測(cè)方法或診斷試劑仍然存在以下兩個(gè)方面的缺陷。?

第一：非均相免疫分析模式帶來(lái)的固有缺陷?

就標(biāo)記免疫分析原理而言，上述三種診斷試劑均屬于非均相免疫分析模式。未與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的游離狀態(tài)標(biāo)記物，和與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合狀態(tài)標(biāo)記物中示蹤劑特性完全相同，測(cè)定前必須去除游離狀態(tài)標(biāo)記物，通常測(cè)定結(jié)合狀態(tài)標(biāo)記物才能反映抗原抗體反應(yīng)的強(qiáng)度。非均相免疫分析采用固相吸附法分離結(jié)合標(biāo)記物和游離標(biāo)記物。固相吸附分離法是將抗原（抗體）吸附在固相載體表面，使免疫反應(yīng)在固相載體表面上進(jìn)行，待測(cè)物質(zhì)（抗體或抗原）、標(biāo)記抗體（抗原）均可通過(guò)免疫反應(yīng)結(jié)合在固相材料表面，未結(jié)合物質(zhì)（含游離標(biāo)記物）存在于液相中。此時(shí)，棄去液相并經(jīng)洗滌，便可去除游離標(biāo)記物。一般情況下，酶免疫分析采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)板作為固相材料，發(fā)光免疫分析采用磁性微球作為固相材料。