[發(fā)明專利]擴(kuò)張性心肌病易感性檢測(cè)試劑盒（CTLA4等基因）

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210234541.1
• 申請(qǐng)日: 2012-07-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103540645A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭俊斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 解碼(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本項(xiàng)目屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種擴(kuò)張性心肌病易感基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果從基因?qū)用嬖u(píng)估人群中擴(kuò)張性心肌病的遺傳易感性的風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，并作為人類預(yù)防和治療擴(kuò)張性心肌病的方向指導(dǎo)。?

背景技術(shù)

擴(kuò)張型心肌病(Dilatedcardiomyopathy，DCM)是最常見(jiàn)的心肌病，也是心力衰竭的主要病因之一。DCM是一種以心腔(左心室和/或右心室)擴(kuò)大、心肌收縮功能障礙為主要特征的心肌疾病，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)制主要與家族或遺傳性有密切聯(lián)系。其發(fā)病年齡為20～50歲，男性居多，在我國(guó)發(fā)病率為13/10萬(wàn)～84/10萬(wàn)左右，約20%的DCM患者有家族病史，5年存活率不到50％，預(yù)后很差。所以必須高度重視該病的危害，及早進(jìn)行預(yù)防和治療。?

DCM的發(fā)生是一個(gè)涉及多基因、多環(huán)節(jié)和多途徑的過(guò)程。DCM的發(fā)生可能是眾多致病因素共同作用的結(jié)果，目前科學(xué)家普遍認(rèn)為遺傳因素在DCM發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用。?

國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，DCM發(fā)病機(jī)制與T細(xì)胞免疫應(yīng)答有很大聯(lián)系。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（Cytotoxic?T?Lymphocyte?Associated?Antigen?4，CTLA-4）基因有3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)子318位點(diǎn)C/T；外顯子1第17密碼子49位點(diǎn)A/G；外顯子4的3'非翻譯區(qū)642位點(diǎn)二核苷酸（AT）n微衛(wèi)星。其中A49-G多態(tài)性與DCM發(fā)生有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4基因外顯子A49-G多態(tài)性與DCM易感性相關(guān)，攜帶G等位基因者易患DCM，其機(jī)制可能為該多態(tài)性造成CTLA-4信號(hào)肽中編碼蘇氨酸和甘氨酸的替換，從而影響蛋白翻譯后加工、修飾，使sCTLA-4功能發(fā)生變化。荷蘭醫(yī)學(xué)家研究同樣表明，CTLA-4基因第一外顯子第49位堿基多態(tài)性改變可導(dǎo)致蛋白前導(dǎo)肽鏈第17位蘇氨酸與丙氨酸互換。同時(shí)他們研究證實(shí)，CTLA-4?基因A49-G多態(tài)性中,?等位基因G多與擴(kuò)張性心肌病有關(guān)。?

CTLA-4基因第一腫瘤壞死因子（Tumor?necrosis?fator，TNF）是一種重要的細(xì)胞因子，主要分為T(mén)NF-α與TNF-β兩種。TNF-α基因具有多態(tài)性，目前已經(jīng)明確-308位點(diǎn)具有多態(tài)性，這主要是由第308位點(diǎn)堿基G變異為A導(dǎo)致的。有研究認(rèn)為-308位點(diǎn)G-A的堿基變化可直接影響轉(zhuǎn)錄水平。Louis等人研究了基因-308位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響，發(fā)現(xiàn)A等位基因攜帶者的TNF-α產(chǎn)量比G等位基因純合子高，認(rèn)為308位點(diǎn)堿基突變影響了TNF-α的產(chǎn)量。Kroeger等人的研究發(fā)現(xiàn)TNF-α基因-308位點(diǎn)的A等位基因比G等位基因的轉(zhuǎn)錄活性高兩倍。?

腫瘤壞死因子-β(tumor?necrosisfactor-alpha，TNF-β)基因第一內(nèi)含子+252位點(diǎn)存在G/A多態(tài)性，可能與TNF的表達(dá)相關(guān)，并可能與DCM疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。有研究表明，DCM患者TNF-β基因+252位點(diǎn)攜帶A等位基因頻率明顯高于正常人，提示該位點(diǎn)的多態(tài)性可能是DCM發(fā)生、發(fā)展的遺傳因素。?

因此，建立簡(jiǎn)單、快速的DCM易感基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法，能夠檢測(cè)出DCM發(fā)生相關(guān)的基因單核苷酸位點(diǎn)基因型，及時(shí)篩查出DCM的高危人群，從而根據(jù)檢測(cè)結(jié)果盡早采取預(yù)防措施，這對(duì)于降低DCM的發(fā)病率具有重要意義。?

??

發(fā)明內(nèi)容

基于?CTLA4基因上A49G（rs231775）、TNF-α基因上G-308A?(rs1800629)、TNF-β基因上A252G?rs909253)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可用來(lái)評(píng)估擴(kuò)張性心肌病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，本發(fā)明提供一種擴(kuò)張性心肌病基因無(wú)創(chuàng)檢測(cè)試劑盒。?

該試劑盒包括：?

檢測(cè)?CTLA4基因上A49G（rs231775）、TNF-α基因上G-308A?(rs1800629)、TNF-β基因上A252G?rs909253)的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及DNA測(cè)序引物；

PCR反應(yīng)組件（包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH₂O等）；

PCR產(chǎn)物純化組件（包括SAP酶、ExoI酶、ddH₂O等）；

DNA測(cè)序反應(yīng)組件（包括BigDye?mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH₂O等）。

本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括：?