[發明專利]一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法

無效

• 申請號: 201210234376.X
• 申請日: 2012-07-09
• 公開（公告）號: CN102766657A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 趙麗萍;趙統敏;楊瑪麗;余文貴
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12P1/02
• 分類號: C12P1/02;C07G99/00;C12R1/645
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

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技術領域：

本發明涉及農業生物技術領域，具體講是一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法。?

背景技術：

灰霉病是番茄設施栽培的重要病害之一，常造成減產30-40%，甚至絕產。番茄灰霉菌（Botrytis?cinereaPers）對寄主的破壞作用極其復雜，其中灰霉病菌產生的非寄主專化性毒素在病原菌的侵染過程中起作用，是主要致病因素之一，它可以造成葉片變色、細胞崩潰、促進病菌的侵染和擴展。毒素作為一個致病或致毒因子來源，可作為一個選擇壓，以殺死敏感細胞，選出抗病細胞，離體條件下篩選抗病突變體，解決番茄抗灰霉病材料缺乏的問題。

對灰霉菌毒素的提取與純化是進行毒素成分研究及利用主要致病毒素成分創制抗源材料的第一步。據文獻報道，目前一般采用有機溶劑萃取的方法，并多用氯仿進行萃取，而氯仿由于毒性大、麻醉性強，不利于操作者的安全。

發明內容：

技術問題??本發明的目的在于提供一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法，該方法不僅簡單易行，容易操作，而且方便進一步的分析與純化，并可以用于抗番茄灰霉病突變體技術的研究。

技術方案??為實現上述目的，本發明采取以下技術方案：

（1）病原菌分離、純化：采集番茄病葉或病果，滅菌處理后，在葉片病健交接處剪取3mm的小塊接入PSA平板內或用接種針接觸果實霉層并在PSA平板上劃線，分離培養1-2d后挑取單菌絲，接入PSA平板，純化2-3次后，轉接于PSA斜面培養基中，4℃保存，

（2）病原菌活化：灰霉菌株從斜面上培養基上接種于PSA平板，置于25℃左右環境中培養3天。

（3）毒素提取：用打孔器打取直徑5mm的菌碟，接入Czapek-Dox培養液中，培養14d或21d后，過濾，減壓濃縮，乙酸乙酯萃取，再進行減壓濃縮，用旋轉蒸發儀去除溶劑，所得棕褐色物質為粗毒素，用分析天平稱毒素質量，按一定濃度加少量丙酮溶解，即獲得毒素粗提液。

（4）毒素純化：用毛細管將毒素粗提液點樣于GF₂₅₄薄層層析板上，以正己烷：乙酸乙酯=（7:3）為展開劑，當展開劑前沿上升至距點樣基線約13?cm處時，取出薄層板自然揮發晾干，放在紫外254nm下觀察。收集相同Rf?值的組分，用2-5ml的丙酮洗脫，離心，得到上清液。

（5）生物測定：采用離體葉片針刺法對上清液進行生物測定，5天后觀察番茄葉片的變化。

（6）保存：對可在葉片上產生類似于灰霉菌感染后的病斑的上清液，作為層析純毒素，4℃下保存備用。

有益效果??本發明不僅提取技術簡單易行，成本低，周期短，而且提取涉及的儀器簡單，從番茄灰霉病菌中提取的毒素可以用于抗番茄灰霉病突變體的誘導，進而獲得抗灰霉病再生植株，為抗番茄灰霉病育種提供重要的基礎材料。???????????????????????????????????????????????

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具體實施方式：

一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法，具體步驟如下：

（1）灰霉病菌分離：

A：PSA培養基的配制

配方為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，用蒸餾水定容至1000ml。

B：病菌的分離

采集感染番茄灰霉菌（Botrytis?cinerea）（張從宇,張巨全,胡能兵,張曉紅.番茄灰霉病菌寄主范圍及致病力分化研究，安徽技術師范學院學報,2003,17(3):239~242。喬樹華，蔣紅云等.石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌抑制作用及防病效果，植物保護，2010，,3（1）:148-150.）的發病初期、癥狀典型的番茄病葉（病斑自葉尖呈“V”字形向內擴展）或病果（果臍部呈灰白色并軟腐，病部長有大量灰色霉層）裝入自封袋中，每只自封袋裝一片葉或一個果實，置于冰盒中。病葉用無菌水清洗2-3次，浸入1％次氯酸鈉溶液中30s，取出后再浸入70％的乙醇溶液3-5min，然后再轉入無菌水中漂洗3次，在病健交接處剪取大約邊長為3mm的小塊接入PSA平板內，每平板內接4-5塊，并于25℃培養箱中培養；或用接種針接觸果實霉層并在PSA平板上劃線。

（2）病原菌純化、保存：

在分離培養1-2d后挑取單菌絲進行純化，將純化2-3次后的病原菌，直接用于毒素的提取或轉接于PSA斜面培養基中于4℃冰箱中保存。

（3）病原菌活化：