[發明專利]一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法

無效

• 申請號: 201210234376.X
• 申請日: 2012-07-09
• 公開（公告）號: CN102766657A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 趙麗萍;趙統敏;楊瑪麗;余文貴
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12P1/02
• 分類號: C12P1/02;C07G99/00;C12R1/645
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.?一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）病原菌分離、純化：采集感染番茄灰霉菌（Botrytis?cinerea?Pers）的病葉或病果，滅菌處理后，在葉片病健交接處剪取邊長約3mm的小塊接入PSA平板內或用接種針接觸果實霉層并在PSA平板上劃線，分離培養1-2d后挑取單菌絲，接入PSA平板，純化2-3次后，轉接于PSA斜面培養基中，4℃保存；

（2）病原菌活化：灰霉菌株從斜面上培養基上接種于PSA平板，置于25℃環境中培養3天；

（3）毒素提取：

A：Czapek-Dox培養液的配制

其配方為：葡萄糖50.0g，酵母浸出液1.0g，NaNO₃?2.0g，FeSO₄?0.01g，K₂HPO₄?0.5g，MgSO₄·7H₂O?0.5g，用蒸餾水定容至1000ml；

B：毒素產生

在灰霉菌絲將要長滿PSA平板時，使用打孔器沿菌落邊緣依次打取直徑5mm的菌碟，將打好的菌碟接入Czapek-Dox培養液中，16菌片/500ml培養液，25℃條件下黑暗培養21d，每天振蕩培養1h，120r/min；

C:減壓濃縮

用雙層紗布濾去菌絲，在50-60℃下進行減壓濃縮；

D：毒素提取

將濃縮后的濾液加等體積的有機溶劑乙酸乙酯于分液漏斗中，充分振蕩10-15?min，靜置15min，移去下層溶液，上層溶液重復萃取2-3次，收集下層溶液，進行減壓濃縮，用旋轉蒸發儀去除溶劑，得到棕褐色物質，用分析天平稱質量，按100g/L的濃度加丙酮溶解，即獲得毒素粗提液；

（4）提取液薄層層析

A：薄層層析板的制作

按質量比硅膠GF₂₅₄:羧甲基纖維素鈉CMC:H₂O=0.4:0.007:1的比例混合，先將CMC與H₂O混合溶解均勻，再加入硅膠研磨，使之完全混勻，將配制好的漿料鋪在干燥潔凈的玻璃板上，使其表面均勻平滑，厚度1mm，涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干，晾干后，放在烘箱內加熱活化，硅膠板在烘箱中漸漸升溫，維持105℃-110℃活化30min；

B：點樣

在距薄層板一端1.5cm處用鉛筆輕輕劃一起始線，用0.5mm毛細管將毒素粗提液點在起始線上，待丙酮揮發后在起始線上重復點樣2-3次，使點樣原點直徑為3mm；

C：展開

待丙酮揮發后，將點好樣品的薄層板放入內襯濾紙的展開槽中，展開槽內預先已放置由體積比正己烷:乙酸乙酯?=?7:3組成的展開劑，展開劑浸沒薄層板點樣起始線的一端0.5cm，薄層板與水平成45-60°角，蓋好槽蓋，讓薄層板在密閉的展開槽中，展開劑在薄層板上展開，當展開劑前沿上升至距點樣基線13?cm處時，取出層析板，立即用鉛筆在展開劑上端前沿處劃記號，置空氣中晾干；

D：顯色

待板自然風干后，放在紫外254nm下觀察；

（5）提取物洗脫

各個樣品間隔一定距離點在起始線上，每個樣品在起始線上的點樣點為原點，層析后計算各組分?Rf?值：原點到組分斑點中心的距離與原點到展開劑前沿的距離（13?cm）的比值；

對具有相同Rf?值的各組分連同吸附劑一起刮下，然后用2-5ml的丙酮將被分離的物質從吸附劑上洗脫下來，各洗脫液12?000rpm下離心10min，得到上清液；

（6）提取物生物測定

培養皿中先鋪一張浸有無菌水的濾紙，取3-4葉期番茄植株葉片，75%酒精消毒后平鋪到濾紙上，每皿放3片，用接種針輕輕刺破葉片，滴入20μl上清液，置于25℃光照培養箱中，3次重復，設同樣濃度的丙酮溶液作為對照，5天后觀察葉片的變化；

（7）提取物保存

對能在葉片上產生類似于灰霉菌感染后的病斑的上清液，作為層析純毒素，4℃下保存備用。

2.根據權利要求1所述的一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法，其特征在于所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基PSA配方為：馬鈴薯200g，?葡萄糖20g，瓊脂20g，用蒸餾水定容至1000ml。