[發明專利]產色氨酸基因工程菌株的構建方法

無效

• 申請號: 201210234304.5
• 申請日: 2012-07-09
• 公開（公告）號: CN102719469A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 于沖;夏海華;曲曉軍;王金英;孫建華;李思明
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

技術領域

本發明涉及一種產色氨酸基因工程菌株的構建方法。

背景技術

色氨酸化學名稱為a-氨基-p-吲哚丙酸，有L型和D型同分異構體，此外還有消旋體DL-色氨酸。L-色氨酸是人和動物的必需氨基酸，參與機體蛋白質合成和代謝網絡調節，廣泛存在于自然界。由于L-色氨酸及其代謝產物對機體的廣泛作用，其在醫學、食品工業、飼料工業等多個領域都有一定的應用。

傳統色氨酸生產方法主要有蛋白水解提取法、化學合成法和酶促轉化法。這3種方法分別存在著材料來源有限、需多步合成工藝及光學拆分難、周期長、底物價格昂貴等缺點，在工業生產中受到極大限制，遠遠滿足不了市場的實際需求。隨著對微生物法生產色氨酸研究的不斷深入，微生物發酵法已經走向生產應用并且處于主導地位，但是從葡萄糖到色氨酸的生物合成途徑比較漫長，其代謝流也比較弱，而且色氨酸的合成需要多種前體物，致使色氨酸的發酵水平較低，生產成本一直較高，極大的影響了色氨酸的應用。若想進一步提高色氨酸的積累量就必須設法增強合成這些前體物的代謝流，解除色氨酸生物合成途徑中的細調系統——弱化子系統。

L-色氨酸是繼蛋氨酸、賴氨酸之后的第三代飼料添加劑，其使用效果是賴氨酸的3～4倍，具有十分廣泛的應用前景，近年來在醫藥、化妝、食品、保健品等行業也得到廣泛的應用。在日本、美國L-色氨酸主要應用于醫藥和飼料領域。飼料級L-色氨酸售價30萬元/t，醫藥級產品進口價格高達80～90萬元/t。目前國內使用的L-色氨酸主要依賴進口，而過高的價格嚴重影響了其在飼料添加劑行業的應用。

目前在工業上，也有用微生物發酵法生產L-色氨酸的，然而在微生物發酵生產色氨酸過程中需加入L-絲氨酸與吲哚，前者價格昂貴，后者對色氨酸合成酶抑制強烈，使得色氨酸在工業生產中成本依然偏高，至今未取得令人滿意的結果。如何提高色氨酸產率、降低生產成本是目前一個重要課題。

發明內容

本發明是要解決目前色氨酸生產方法存在色氨酸產率低、成本高的問題，提供產色氨酸基因工程菌株的構建方法。

本發明產色氨酸基因工程菌株的構建方法，按以下步驟進行：

一、用細菌基因組提取試劑盒提取大腸桿菌JMl09的基因組DNA；二、以大腸桿菌JMl09基因組DNA為模板，以P1、P2為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物A用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，獲得目的基因aroG；三、將目的基因aroG與pMD18-T載體進行連接，構建重組載體pMD18-T-aroG；四、以大腸桿菌JMl09基因組DNA為模板，以P3、P4為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物B用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，獲得目的基因trpBA；五、將目的基因trpBA與pMD18-T載體進行連接，構建重組載體pMD18-T-trpBA；六、將重組載體pMD18-T-aroG和pET-32a載體分別經EcoR?I和BamH?I進行雙酶切，將酶切后的重組載體pMD18-T-aroG經1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收aroG片段，將aroG片段和酶切后的pET-32a連接，獲得連接產物X；七、將重組載體pMD18-T-trpBA和pET-30a載體分別經EcoR?I和BamH?I進行雙酶切，將酶切后的重組載體pMD18-T-trpBA經1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收trpBA片段，將trpBA片段和酶切后的pET-30a連接，獲得連接產物Y；八、將連接產物X轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞中，涂布于含0.1mg/mL?Amp的LB培養基中，次日挑取單菌落接種到含0.1mg/mL?Amp的LB培養基中，于37℃振動培養12～16h，然后提取質粒進行鑒定，鑒定正確的菌落即為含有連接產物X的大腸桿菌BL21感受態細胞；九、將連接產物Y轉化至含有連接產物X的大腸桿菌BL21感受態細胞中，涂布于含有0.1mg/mL?Amp和0.05mg/mL?Kana的LB培養基中，次日挑取單菌落接種到含0.1mg/mLAmp和0.05mg/mL?Kana的LB培養基中，于37℃振動培養12～16h，提取質粒進行鑒定，鑒定正確的陽性重組菌即為產色氨酸基因工程菌株。