[發明專利]產色氨酸基因工程菌株的構建方法

無效

• 申請號: 201210234304.5
• 申請日: 2012-07-09
• 公開（公告）號: CN102719469A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 于沖;夏海華;曲曉軍;王金英;孫建華;李思明
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

1.產色氨酸基因工程菌株的構建方法，其特征在于產色氨酸基因工程菌株的構建方法，按以下步驟進行：

一、用細菌基因組提取試劑盒提取大腸桿菌JMl09的基因組DNA；二、以大腸桿菌JMl09基因組DNA為模板，以P1、P2為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物A用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，獲得目的基因aroG；三、將目的基因aroG與pMD18-T載體進行連接，構建重組載體pMD18-T-aroG；四、以大腸桿菌JMl09基因組DNA為模板，以P3、P4為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產物B用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用膠回收試劑盒進行純化，獲得目的基因trpBA；五、將目的基因trpBA與pMD18-T載體進行連接，構建重組載體pMD18-T-trpBA；六、將重組載體pMD18-T-aroG和pET-32a載體分別經EcoRI和BamHI進行雙酶切，將酶切后的重組載體pMD18-T-aroG經1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收aroG片段，將aroG片段和酶切后的pET-32a連接，獲得連接產物X；七、將重組載體pMD18-T-trpBA和pET-30a載體分別經EcoR?I和BamH?I進行雙酶切，將酶切后的重組載體pMD18-T-trpBA經1％瓊脂糖凝膠電泳，膠回收trpBA片段，將trpBA片段和酶切后的pET-30a連接，獲得連接產物Y；八、將連接產物X轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞中，涂布于含0.1mg/mL?Amp的LB培養基中，次日挑取單菌落接種到含0.1mg/mL?Amp的LB培養基中，于37℃振動培養12～16h，然后提取質粒進行鑒定，鑒定正確的菌落即為含有連接產物X的大腸桿菌BL21感受態細胞；九、將連接產物Y轉化至含有連接產物X的大腸桿菌BL21感受態細胞中，涂布于含有0.1mg/mL?Amp和0.05mg/mL?Kana的LB培養基中，次日挑取單菌落接種到含0.1mg/mLAmp和0.05mg/mL?Kana的LB培養基中，于37℃振動培養12～16h，提取質粒進行鑒定，鑒定正確的陽性重組菌即為產色氨酸基因工程菌株。

2.根據權利要求1所述的產色氨酸基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟二中PCR擴增所用引物P1為5′-CGGAATTCCATCCTCTCTAGA-3′，引物P2為5′-CGGGATCCACGTCATTCGTTT-3′。

3.根據權利要求1所述的產色氨酸基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟四中PCR擴增所用引物P3為5′-CGGAATTCTTTCTTACCCCGGT-3′，引物P4為5′-CGGGATCCCGCTTGGCAACGTT-3′。

4.根據權利要求1所述的產色氨酸基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟二中PCR擴增的反應體系如下：

PCR擴增條件為：98℃變性10min，98℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環，再72℃延伸10min，4℃保存。

5.根據權利要求1所述的產色氨酸基因工程菌株的構建方法，其特征在于步驟四中PCR擴增的反應體系如下：

PCR擴增條件為：98℃變性10min，98℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環，再72℃延伸10min，4℃保存。