[發明專利]一種固定化酶法連續轉化生產γ-氨基丁酸的方法

無效

• 申請號: 201210233749.1
• 申請日: 2012-07-06
• 公開（公告）號: CN102719500A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 高智慧;任麗梅;余瓊林;劉磊;王文芳;丁國鈺
• 申請（專利權）人: 天津啟仁醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N15/60;C12N15/70;C12N9/88;C12N11/12
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明屬于生物技術生產氨基酸的技術領域，涉及通過固定化酶法生產γ-氨基丁酸的方法。

背景技術

γ-氨基丁酸是一種具有很高生理活性的天然氨基酸，廣泛分布于動植物中。是目前研究較為深入的一種重要的抑制性神經遞質，參與多種代謝活動。根據目前的研究，發現γ-氨基丁酸的生理活性主要表現在以下幾方面：（1）鎮靜神經、抗焦慮；（2）降低血壓；（3）治療帕金森病、癲癇、老年癡呆等疾病；（4）降低血氨，以解決氨毒，從而增進肝機能；（5）提高腦活力；（6）促進乙醇代謝；（7）其他如防止皮膚老化、消除體臭、改善脂質代謝、防止動脈硬化高效減肥等功能。γ-氨基丁酸目前在醫藥中已有廣泛的應用，同時作為一種具有顯著藥理作用的功能性因子，其在食品工業中的應用也越來越受關注。

由于γ-氨基丁酸在動植物原料中含量很低，很難直接從天然組織中大量提取得到，目前γ-氨基丁酸的制備方法主要有化學合成法和生物合成法。但是，化學合成法得率較低，并且在生產工藝中使用危險溶劑，甚至是有毒溶劑，因此化學合成法制備的γ-氨基丁酸不宜用于食品添加劑使用。

生物合成法主要是利用酶催化轉化，在γ-氨基丁酸支路中合成。該方法生產成本低、無毒、安全環保，屬于低碳、綠色生產方式。就酶源而言，可分為兩種途徑：植物組織代謝和微生物發酵。其中，植物組織代謝主要利用內源酶轉化制備γ-氨基丁酸，分為植物組織生長代謝和立體植物組織應激代謝兩種方式。微生物發酵法主要是利用谷氨酸脫羧酶（GAD）生物催化谷氨酸脫羧生成γ-氨基丁酸。至今為止，被發現具有GAD活性并用來制備γ-氨基丁酸的微生物主要包括大腸桿菌E.coli、乳酸菌、酵母菌、紅曲霉菌等，表1是目前微生物生產γ-氨基丁酸的情況。

表1微生物生產γ-氨基丁酸的研究概況

目前，生物合成法是γ-氨基丁酸的主流生產技術，綜合比較國內外生物合成法生產γ-氨基丁酸,不同菌株及不同的生產方式,γ-氨基丁酸的產量差別較大，且發酵周期均較長，發酵結束后如何將產物從成分復雜的發酵液分離、純化，也成為生產流程中復雜、耗時、增加成本的一環。近年來，隨著酶固定化技術在醫藥工業的發展應用，有關固定化GAD轉化γ-氨基丁酸的研究也已有報道，吳國琪等（分析化學，1999，27（7）：759-763采用羧甲基化的烯丙基葡聚糖生化樹脂，林少琴等（藥物生物技術，2005，12（2）：101-105）采用殼聚糖材料固定GAD，陳蔚青等人（中國生化藥物雜志，2007，28（4）：224-227）采用海藻酸鈉與明膠協同作用固定化，以海藻酸鈉和明膠為載體，通過氯化鈣硬化、戊二醛交聯，對大腸桿菌GAD進行包埋法固定化，并嘗試采用填充床反應器連續反應制備γ-氨基丁酸，但反應效率還有待改進提高。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的固定化酶法連續轉化生產γ-氨基丁酸的綠色合成方法。

本發明方法涉及基因工程菌大腸桿菌BL21(DE3)-pET35b-GAD和BL21(DE3)-pET21(+)-GAD，以底物L-谷氨酸鈉或L-谷氨酸出發，經表達的谷氨酸脫羧酶或者固定化的基因工程菌表達的谷氨酸脫羧酶直接轉化L-谷氨酸鈉或L-谷氨酸，制備γ-氨基丁酸。

本發明所述的固定化酶法連續轉化生產γ-氨基丁酸的具體方法是：

以固定化重組表達的纖維素結合域-谷氨酸脫羧酶（簡稱“固定化酶”）融合蛋白為酶源，濃度為0.05mM~0.15mM的磷酸吡哆醛存在的條件下，進行酶促反應，反應過程中，向反應體系中加入固定化酶4mL/L至20mL/L，底物L-谷氨酸鈉或L-谷氨酸為20g/L至50g/L，溫度25至50℃，pH值為4至6，經酶法轉化反應1h至4h生產γ-氨基丁酸，并進一步分離獲得γ-氨基丁酸粉末或晶體。

酶促反應優選轉化溫度為37℃；優選轉化pH值為5.5；優選轉化時間為2h；底物L-谷氨酸鈉或L-谷氨酸的用量優選分別為40g/L；輔酶磷酸吡哆醛濃度為0.1mM；固定化酶優選用量為8mL/L。

固定化酶源可重復使用15次以上，且在最佳的反應條件和體系下，連續轉化10次，其催化底物轉化率均能夠達93%以上。

所述的固定化重組表達的纖維素結合域-谷氨酸脫羧酶融合蛋白的制備方法是：