[發明專利]一種固定化酶法連續轉化生產γ-氨基丁酸的方法

無效

• 申請號: 201210233749.1
• 申請日: 2012-07-06
• 公開（公告）號: CN102719500A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 高智慧;任麗梅;余瓊林;劉磊;王文芳;丁國鈺
• 申請（專利權）人: 天津啟仁醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N15/60;C12N15/70;C12N9/88;C12N11/12
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

1.一種采用固定化酶法連續轉化生產γ-氨基丁酸的方法，其特征在于該方法包括：

以固定化重組表達的纖維素結合域-谷氨酸脫羧酶融合蛋白、簡稱“固定化酶”為酶源，濃度為0.05mM~0.15mM的磷酸吡哆醛存在的條件下，進行酶促反應，反應過程中，向反應體系中加入固定化酶4mL/L至20mL/L，底物L-谷氨酸鈉或L-谷氨酸為20g/L至50g/L，溫度25至50℃，pH值為4至6，經酶法轉化反應1h至4h生產γ-氨基丁酸，并進一步分離獲得γ-氨基丁酸粉末或晶體。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的固定化重組表達的纖維素結合域-谷氨酸脫羧酶融合蛋白的制備方法是：

首先，構建高效融合表達纖維素結合域-谷氨酸脫羧酶的基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，即以大腸桿菌BL21的基因組為模板進行PCR擴增谷氨酸脫羧酶基因，構建pET21(+)-GAD表達載體，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，隨后將確認的GAD基因轉入pET35b，獲得重組表達載體pET35b-GAD，再構建基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，并在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達；

以上述重組基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3)-pET35b-GAD的細胞裂解液為起始酶源，經過纖維素載體吸附，完成固定化，得到固定化酶。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述的谷氨酸脫羧酶基因來源于構建的重組菌株BL21(DE3)-pET21a(+)-GAD，該菌株具備可表達谷氨酸脫羧酶融合蛋白，并能夠將L-谷氨酸或其鈉鹽轉化為γ-氨基丁酸。

4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述的纖維素載體包括纖維素微球、纖維素凝膠、脫脂棉和濾紙。

5.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于：固定化酶采用纖維素結合域-谷氨酸脫羧酶融合蛋白特異性吸附固定的方式，或采用交聯劑進一步交聯固定的方式，其中交聯劑為戊二醛，濃度為0.1%。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：酶促反應優選轉化溫度為37℃；優選轉化pH值為5.5；優選轉化時間為2h；底物L-谷氨酸鈉或L-谷氨酸的用量優選分別為40g/L；輔酶磷酸吡哆醛濃度為0.1mM；固定化酶優選用量為8mL/L。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：固定化酶源可重復使用15次以上，且在最佳的反應條件和體系下，連續轉化10次，其催化底物轉化率均能夠達93%以上。