[發明專利]一種體外準確檢測KRAS基因突變的方法

有效

• 申請號: 201210233090.X
• 申請日: 2012-07-06
• 公開（公告）號: CN102796816A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 劉金輝;陳超;戴鵬高;王鴻
• 申請（專利權）人: 陜西北美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 陳廣民

技術領域

本發明涉及一種檢測KRAS基因突變的方法。

背景技術

基因突變是指基因組DNA分子在結構功能上發生堿基組成或排列順序的改變，主要包括堿基的替代和片段的插入缺失，是導致基因型疾病的重要原因之一。基因突變分析在生物醫學研究中，尤其是在基因型疾病診斷及病理研究中有著非常重要的作用。KRAS基因編碼的蛋白參與由表皮生長因子受體(EGFR)介導的細胞信號轉導通路，影響細胞的增殖、生長和轉移；正常的KRAS基因編碼的蛋白在接受上游信號活化后被激活，并將在信號傳遞給下游細胞因子后恢復非激活狀態；而突變的KRAS基因所編碼的蛋白無需上游信號活化便始終處于激活狀態，導致細胞的非正常增殖和生長，引起惡性腫瘤。抗EGFR類腫瘤藥物通過特異性阻滯EGFR與受體結合，阻斷細胞轉導通路，從而達到抑制癌細胞增殖的目的；多項研究發現，接受抗EGFR藥物治療的結直腸癌患者中，KRAS基因野生型的病人較KRAS基因突變型病人更能從治療中受益：具有更高的藥物客觀反應率和較長的生存時間。因此，能夠準確檢測KRAS突變狀態對指導結直腸癌患者臨床用藥有重要意義。人類KRAS基因的突變主要發生該基因第二號外顯子上，其中最常見的突變有G12S、G12R、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D7種形式。

傳統檢測KRAS基因突變的方法多種多樣，其中最為經典是雙脫氧測序技術，此外還包括等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、連接酶檢測反應(LDR)、多聚酶鏈限制性長度多態性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技術。雖然這些方法能夠檢測突變是否存在，但大多數方法不能確定突變的類型并且只能檢測到突變的一部分；同時大多數方法需要瓊脂糖凝膠電泳等PCR后處理檢測才能分析結果，準確度和靈敏度受到限制。近年來，蝎型引物(Scorpion?primers)、高分辨溶解曲線(HRM)、變性高效液相色譜分析(dHPLC)和焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)等方法技術改善了檢測的靈敏度和特異性，但仍存在耗材昂貴，假陽性現象嚴重和操作繁瑣等缺點。

等位基因特異性PCR(Allele-specific?PCR)，也稱為ARMS(Amplification?refractory?mutation?system)技術，是一種利用特異性引物對模板進行選擇性擴增而達到檢測基因突變的方法。其原理是根據PCR過程中DNA聚合酶引導的引物延伸從3'末端開始，所以引物3'末端的堿基與模板的互補程度強烈影響聚合酶的識別作用和PCR反應的進行:若這個堿基與模板正?；パa配對(A-T,G-C)，則引物可以不間斷延伸，PCR得以高效進行，得到完整的產物；反之，若這個堿基與模板非正常配對，則引物的延伸受到阻滯，PCR效率大大降低。故只需將與突變位點對應的堿基放置在引物的3'末端，當用突變型特異性引物進行PCR擴增時，只要突變型模板可以得到擴增，而野生型模板的擴增受到了抑制。SYBR?Green是一種DNA結合染料，可以非特異性與DNA雙鏈小溝結合。在游離狀態下SYBR?Green只有本底水平熒光，而與DNA結合后其熒光強度增強1000倍以上。PCR反應過程中，產物成指數形式擴增，熒光強度也隨之倍增，起到實時監測作用。傳統的等位基因PCR法特異性不足，常常出現假陽性現象，使得檢測結果不準確。

發明內容

為了克服傳統等位基因特異性PCR法特異性不足，存在假陽性現象的缺點，本發明提供了一種體外準確檢測KRAS基因突變的方法，通過設計高特異性引物與延伸阻滯引物，結合快速PCR法實現體外準確檢測KRAS突變。

為實現以上發明目的，本發明的基本技術方案如下：

一種體外準確檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟：

（1）等位基因特異性引物的設計及合成

針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變分別設計等位基因特異性引物，作為上游引物；序列信息如下：

G12S5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcA-3'????(24nt)

G12R5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCaC-3'????(24nt)

G12C5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcT-3'????(24nt)

G12D5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcA-3'???(25nt)

G12A5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTaC-3'???(25nt)