[發明專利]一種體外準確檢測KRAS基因突變的方法

有效

• 申請號: 201210233090.X
• 申請日: 2012-07-06
• 公開（公告）號: CN102796816A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 劉金輝;陳超;戴鵬高;王鴻
• 申請（專利權）人: 陜西北美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 陳廣民

1.一種體外準確檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟：

（1）等位基因特異性引物的設計及合成

針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變分別設計等位基因特異性引物，作為上游引物；序列信息如下：

G12S5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcA-3'????(24nt)

G12R5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCaC-3'????(24nt)

G12C5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCcT-3'????(24nt)

G12D5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcA-3'???(25nt)

G12A5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTaC-3'???(25nt)

G12V5'-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTcT-3'???(25nt)

G13D5'-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTcA-3'????(24nt)；

針對KRAS基因第二號外顯子典型的7種突變設計共同的下游引物為延伸阻滯引物；序列信息如下

延伸阻滯引物(38nt)：

（2）模板的準備

提取被測樣本的KRAS基因組DNA；另制取野生型基因組DNA；

（3）實時熒光PCR

針對步驟（1）中的7種特異性引物，建立被測樣本、野生型模板的反應體系；

被測樣本的每個反應體系中均加入被測樣本的KRAS基因組DNA、特異性引物和延伸阻滯引物；野生型模板的每個反應體系中均加入野生型基因組DNA、特異性引物和延伸阻滯引物；

將配制好的各反應體系在熒光實時定量PCR儀上進行擴增，觀察比較特異性引物對應的被測樣本、野生型模板的反應體系的擴增曲線，判斷被測樣本中是否發生了KRAS突變。

2.根據權利要求1所述的體外準確檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于：所有反應體系中還均加有UNG酶和2×SYBR?Green?Mastermix。

3.根據權利要求2所述的體外準確檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于，步驟（3）的反應體系采用以下兩種模式之一：

a模式：針對每一種特異性引物，均分別建立被測樣本、野生型模板的反應體系；

b模式：將7種特異性引物分為三類；其中，G12S、G12R、G12C為一類，G12A、G12D、G12V為一類，G13D為一類；針對這三類特異性引物，均分別建立被測樣本、野生型模板的反應體系。

4.根據權利要求3所述的體外準確檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于：

以每個反應體系的總量20μl計，采用上述a模式，則：加入特異性引物200nM-500nM、延伸阻滯引物200nM-500nM，UNG酶0.2U，2×SYBR?Green?Mastermix10μl，ddH2O補足體積20μl；

或者，以每個反應體系的總量20μl計，采用上述b模式，則：將G12S、G12R、G12C上游引物按200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滯引物300nM構成混合引物體系；將G12A、G12D、G12V上游引物按200nM:200nM:300nM比例混合，再加入所述延伸阻滯引物300nM構成混合引物體系；G13D上游引物200nM-500nM與延伸阻滯引物300nM構成單獨的引物體系；這三類引物體系也均加入有UNG酶0.2U，2×SYBR?Green?Mastermix10μl，ddH2O補足體積20μl。

5.根據權利要求1至4任一所述的體外準確檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于：步驟（3）中的擴增參數為：50℃，2~5min；95℃，12~15min；95℃，8~10sec；60℃，8~10sec；65℃，8~10sec；50~55個循環。