[發明專利]一種胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體

無效

• 申請號: 201210232385.5
• 申請日: 2012-07-06
• 公開（公告）號: CN103627720A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 范忠澤;王金玉;孫玨;李琦;趙成根;張隆;殷佩浩;李大力;葉乃菁
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學附屬普陀醫院
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66
• 代理公司: 上海信好專利代理事務所(普通合伙) 31249
• 代理人: 賈慧琴

1.一種胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，該真核表達載體是包含ATP4B啟動子序列、SV40T基因序列、以及攜帶綠色熒光蛋白GFP基因序列的載體質粒DNA序列的基因融合重組質粒；

所述的ATP4B啟動子序列是在胃黏膜上皮細胞中特異性表達的H^＋／K^＋?ATP酶的β亞基啟動子序列；

所述的SV40T序列是猿猴病毒抗原蛋白基因序列；

所述的綠色熒光蛋白GFP基因是報告基因；

所述的載體質粒是可以在宿主中復制和生存的真核表達質粒。

2.如權利要求1所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的真核表達載體通過以下方法構建：

???????步驟1，克隆ATP4B啟動子序列；

???????步驟2，將步驟1所得的ATP4B啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒中，并進行驗證；

???????步驟3，將SV40T基因序列插入步驟2所得的攜帶ATP4B啟動子序列和GFP基因序列的載體質粒，并進行酶切鑒定和測序。

3.如權利要求2所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的步驟1的克隆ATP4B啟動子序列，是以小鼠DNA為模板，經PCR擴增后獲得ATP4B啟動子序列，其大小為1022bp。

4.如權利要求3所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的PCR擴增，

上游引物為5'-GCTCTTTCCTCTGGGTCTGT-3'，

下游引物為5'-GAAGCGTCCTCTAGGGCTTA-3'，

退火溫度為57℃。

5.如權利要求2所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的步驟2將ATP4B啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒，是指將攜帶GFP基因序列的載體經限制性內切酶酶切后，去除其包含的啟動子，經瓊脂糖電泳純化后，再插入構建好的包含限制性內切酶位點的ATP4B啟動子序列。

6.如權利要求5所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的步驟2將ATP4B啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒，是以所述的步驟1構建的ATP4B克隆為模板，用包含Ase1和Xhol1兩個內切酶位點的引物將其插入攜帶GFP基因序列的載體質粒。

7.如權利要求6所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的包含Ase1和Xhol1兩個內切酶位點的引物為：

上游引物5'-GCATTAATTTCCTCTGGGTCTGTTTGGT-3'??ASE1，

下游引物5'-TTCTCGAGGCCCAGGAAGCGTCCTCTAGGGCTTA3'??XHO1。

8.如權利要求2所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的步驟2的驗證，是指采用限制性內切酶Nhe1/Sac1?和?Ase1/Xho1進行酶切驗證。

9.如權利要求2所述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其特征在于，所述的步驟3的酶切鑒定，是指采用Pst1和Ase1進行酶切驗證。