[發明專利]一種胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體

無效

• 申請號: 201210232385.5
• 申請日: 2012-07-06
• 公開（公告）號: CN103627720A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 范忠澤;王金玉;孫玨;李琦;趙成根;張隆;殷佩浩;李大力;葉乃菁
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學附屬普陀醫院
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66
• 代理公司: 上海信好專利代理事務所(普通合伙) 31249
• 代理人: 賈慧琴

技術領域

本發明涉及一種真核表達載體，具體地，涉及一種胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP融合基因的真核表達載體。

背景技術

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，據世界衛生組織(WHO)2006年度報道，2005年全球65億人口中因癌癥死亡的有760萬人，約占當年5800萬死亡總人數的13%，其中胃癌居腫瘤死亡率的第二位，每年約有100多萬病人死于胃癌，資料還表明世界近三分之二的胃癌病例在發展中國家。在我國，胃癌死亡率一直居惡性腫瘤死亡的第一位，上海市也是全國胃癌相對高發區之一，胃癌死亡率為35.32/10萬。胃癌是個多因素的疾病，隨著對癌基因研究的不斷深入，發現與140多種基因及其蛋白產物密切相關。近年來，隨著人們對腫瘤免疫、腫瘤病因及分子機制等研究的不斷深入，惡性腫瘤的基因治療已成為當前臨床腫瘤研究的新熱點。腫瘤基因治療已成為目前攻克和治愈腫瘤最具希望的，也是最活躍的領域。

SV40(simian?virus?40)是20世紀60年代初發現并分離出的猿猴腎細胞病毒，具有轉化動物細胞和誘發腫瘤的特性。SV40Tag（SV40T，猿猴病毒抗原蛋白）被廣泛用于腫瘤發病機制的研究與轉基因動物模型的建立，如利用SV40T基因已建立了小鼠腦脈絡叢乳頭狀瘤、胰腺癌、肝癌等轉基因動物模型。

H^＋／K^＋?ATP?酶(H^＋／K^＋?ATPase)基因在胃黏膜上皮細胞中特異性表達，和胃酸的合成與分泌有著直接的關系。

綠色熒光蛋白(Green?Fluorescent?Protein，GFP)基因是1992年被克隆鑒定的新的報告基因。研究表明，GFP所產生的熒光無種屬特異性，不干擾細胞的生長與功能，可耐受光漂白，表達檢測時不需要任何協同因子，也不需要底物。

發明內容

本發明的目的是提供一種胃黏膜上皮細胞H^＋／K^＋?ATPaseβ亞基（ATP4B）啟動子驅動下的SV40Tag-GFP融合基因的真核表達載體，為進一步研究胃癌發生機制及開展胃癌的診斷與基因治療奠定提供研究對象，奠定實驗基礎。

為了達到上述目的，本發明提供了一種胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，該真核表達載體是包含ATP4B啟動子序列、SV40T基因序列、以及攜帶綠色熒光蛋白GFP基因序列的載體質粒DNA序列的基因融合重組質粒；所述的ATP4B啟動子序列是在胃黏膜上皮細胞中特異性表達的H^＋／K^＋?ATP酶的β亞基啟動子序列，和胃酸的合成與分泌有關；所述的SV40T序列是猿猴病毒抗原蛋白基因序列，該蛋白具有轉化動物細胞和誘發腫瘤的特性，SV40T被廣泛用于腫瘤發病機制的研究與轉基因動物模型的建立；所述的綠色熒光蛋白GFP基因是報告基因，所述的報告基因（reporter?gene）是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，即是一種其表達產物非常容易被鑒定的基因，把它的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控，篩選得到轉化體；所述的載體質粒是可以在宿主中復制和生存的真核表達質粒。

上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其中，所述的真核表達載體通過以下方法構建：步驟1，克隆ATP4B啟動子序列；步驟2，將步驟1所得的ATP4B啟動子序列插入攜帶GFP基因序列的載體質粒中，并進行驗證；步驟3，將SV40T基因序列插入步驟2所得的攜帶ATP4B啟動子序列和GFP基因序列的載體質粒，并進行酶切鑒定和測序。

上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其中，所述的步驟1的克隆ATP4B啟動子序列，是以小鼠DNA為模板，經PCR擴增后獲得ATP4B啟動子序列，其大小為1022bp。

上述的胃黏膜上皮細胞ATP4B啟動子驅動的SV40T-GFP真核表達載體，其中，所述的PCR擴增，上游引物為5'-GCTCTTTCCTCTGGGTCTGT-3'，下游引物為5'-GAAGCGTCCTCTAGGGCTTA-3'，退火溫度為57℃。