[發明專利]直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的引物及方法

有效

• 申請號: 201210231272.3
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN102766687A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 廖金鈴;胡茂秀;卓侃
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

技術領域

本發明涉及利用分子生物學方法對植物有害線蟲進行檢測的技術領域，具體涉及直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的引物及方法。

背景技術

根結線蟲（Meloidogyne）是植物根系專性內寄生物，分布遍及世界大部分地區。因其適應性強、傳播途徑多樣、可侵染多種植物，而成為世界性威脅農業生產的主要病原物，給農業生產者造成極大的經濟損失。腎形腎狀線蟲（Rotylenchulus?reniformis），作為腎狀線蟲屬的模式種，對農業生產危害嚴重，主要發生在熱帶和亞熱帶地區，寄主范圍廣，在葫蘆科（Cucurbitaceae）、茄科（Solanaceae）和豆科（Leguminosae）等各種蔬菜作物以及其它多種經濟作物上侵染寄生。瓜類作物由于腎形腎狀線蟲侵染與寄生，引起根皮層組織壞死、根變褐，植株矮化、葉片發黃、變小，進而導致產量下降。根據我們2009-2011年對我國8個省市26個地區57份黃瓜根圍土壤植物寄生線蟲的調查鑒定，根結線蟲和腎形腎狀線蟲檢出率分別為59.6%和63.2%，為黃瓜根圍主要植物寄生線蟲。

土壤是植物寄生線蟲主要生存場所。目前常規的線蟲鑒定方法，無論是形態鑒定還是分子鑒定，都需要先將土壤中的線蟲分離出來，費時費力。因此，探索直接從土壤中提取DNA方法，進而直接對根結線蟲和腎形腎狀線蟲進行快速分子檢測，對作物線蟲病害的有效防控具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中不能從土壤中直接同時檢測根結線蟲和腎形腎狀線蟲的不足，提供一組能直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的引物。

本發明的另一目的是提供一種直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的方法。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

一組直接檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的引物，核苷酸序列如下：

D2A：SEQ?ID?NO:1（5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3'）；

D3B：SEQ?ID?NO:2（5'-TGCGAAGGAACCAGCTACTA-3'）；

NF3：SEQ?ID?NO:3（5’-?GTGAGGGAAAGTTGCAAAGCACT?-3’）；

NR0：SEQ?ID?NO:4（5’-?GTTCACCATCTTTCGGGTCTCAC?-3’）；

MF0：SEQ?ID?NO:5（5’-?GGGGATGTTTGAGGCAGATTTG?-3’）；

和RF4：SEQ?ID?NO:6（5’-?GGTCTGGCTCCCATGTTTTCCA?-3’）。

一種直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的方法，步驟如下：

（1）提取待測土壤DNA、純化；

（2）巢式PCR擴增：進行兩輪PCR擴增反應，第一輪以待測土壤DNA為模板，用核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～2（D2A和D3B）所示的線蟲通用引物進行PCR擴增；第二輪以第一輪PCR產物為模板，SEQ?ID?NO:3～6所示的引物進行PCR擴增；

（3）結果分析：

①?第二輪PCR擴增產物含有617~624bp和424~431bp的序列，表明待測土壤中含有根結線蟲（如果使用電泳檢測，判斷標準為在600bp和400bp左右出現擴增片段條帶）；

②?第二輪PCR擴增產物含有644bp和265bp的序列，表明待測土壤中含有腎形腎狀線蟲（電泳檢測標準為在600bp和250bp左右出現擴增片段條帶）；

③?第二輪PCR擴增產物含有617~644bp、424~431bp和265bp的序列，表明待測土壤中同時含有根結線蟲和腎形腎狀線蟲（電泳檢測標準為在600bp、400bp和250bp左右出現3條擴增片段）。

作為一種優選方案，上述直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的方法中，步驟（3）結果分析中①第二輪PCR擴增產物含有617bp和424bp的序列時，表明待測土壤中含有南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、納西根結線蟲和/或象耳豆根結線蟲；擴增產物中含有620bp和427bp的序列時，表明待測土壤中含有北方根結線蟲；擴增產物中含有624bp和431bp的序列時，表明待檢測土壤中含有擬禾本科根結線蟲和/或禾本科根結線蟲。