[發明專利]直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的引物及方法

有效

• 申請號: 201210231272.3
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN102766687A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 廖金鈴;胡茂秀;卓侃
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

1.一組直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的引物，其特征在于核苷酸序列如下：

D2A：SEQ?ID?NO:1；?

D3B：SEQ?ID?NO:2；

NF3：SEQ?ID?NO:3；

NR0：SEQ?ID?NO:4；

MF0：SEQ?ID?NO:5；

和RF4：SEQ?ID?NO:6。

2.???一種直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的方法，其特征在于步驟如下：

（1）提取待測土壤DNA、純化；

（2）巢式PCR擴增：進行兩輪PCR擴增反應，第一輪以待測土壤DNA為模板，用核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～2所示的線蟲通用引物進行PCR擴增；第二輪以第一輪PCR產物為模板，SEQ?ID?NO:?3～6所示的引物進行PCR擴增；

（3）結果分析：

①?第二輪PCR擴增產物含有617~624bp和424~431bp的序列，表明待測土壤中含有根結線蟲；

②?第二輪PCR擴增產物含有644bp和265bp的序列，表明待測土壤中含有腎形腎狀線蟲；

③?第二輪PCR擴增產物含有617~644bp、424~431bp和265bp的序列，表明待測土壤中同時含有根結線蟲和腎形腎狀線蟲。

3.根結權利要求2所述直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的方法，其特征在于步驟（3）結果分析中①第二輪PCR擴增產物含有617bp和424bp的序列時，表明待測土壤中含有南方根結線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、納西根結線蟲和/或象耳豆根結線蟲；擴增產物中含有620bp和427bp的序列時，表明待測土壤中含有北方根結線蟲；擴增產物中含有624bp和431bp的序列時，表明待檢測土壤中含有擬禾本科根結線蟲和/或禾本科根結線蟲。

4.根據權利要求2所述直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的方法，其特征在于步驟（1）中提取待測土壤DNA使用的抽提緩沖液為：20mM?EDTA，1.5M?NaCl，500mM?Tris-HCl，質量體積比為10%的SDS水溶液，質量體積比為1%的PVP水溶液；其中Tris-HCl的pH值為8.0。

5.根據權利要求2所述直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的方法，其特征在于步驟（1）中的純化是使用試劑盒PowerClean??DNA?Clean-Up?Kit。

6.根據權利要求2所述直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的方法，其特征在于步驟（1）提取待測土壤DNA具體為：

①待檢測土壤與預熱的抽提緩沖液混勻；

②加入蛋白酶K，混勻后在65℃下消化1小時后震蕩10min；

③12000g室溫離心5min，取上清加入Tris-飽和苯酚，顛倒混勻，4℃?12,000g離心10min；

④將上清轉入干凈的離心管，加入氯仿體和異戊醇積比為24：1的混合液，顛倒混勻，4℃?12,000g離心10min；

⑤將上清轉入干凈的離心管，加入3M，pH?5.2的冰醋酸，加入量為上清體積的1/10，再加入上清體積2倍的冷無水乙醇，混勻后–20℃靜置20min，4℃?12,000g離心10min，棄盡上清；

⑥分別用體積百分含量為70%的乙醇和無水乙醇各洗沉淀一次，室溫晾干；

⑦加滅菌雙蒸水復溶，可得到粗提的土壤DNA。

7.根據權利要求2所述直接同時檢測土壤中根結線蟲和腎形腎狀線蟲的方法，其特征在于步驟（2）第一輪PCR的反應體系為：2×PCR?buffer?12.5?μL，2mmol/L?dNTPs?5?μL，10μmol/L?引物SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2各0.5μL，?KOD?Fx?0.5μL，DNA模板1.0?μL和余量的ddH₂O，共?25.0μL；

PCR擴增條件為：94℃預變性2?min；94℃變性30?s，55℃退火30?s，68℃延伸30?s，共30個循環；最后72℃后延伸5?min。