[發(fā)明專利]焦磷酸測序法檢測抗葉酸類制劑個體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒及方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210230457.2
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN102796814A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周宏灝
• 申請（專利權(quán)）人: 周宏灝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及焦磷酸測序法檢測抗葉酸類制劑個體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒及方法。

背景技術(shù)

5-氟尿嘧啶(5-FU)目前仍然是使用最廣泛的抗葉酸類抗腫瘤藥物，用于多種實體腫瘤，如結(jié)直腸癌、乳腺癌等的藥物治療。5-FU可使部分患者得到顯效治療，但常伴隨者嚴(yán)重的胃腸道毒副作用和血液毒性反應(yīng)，甚至導(dǎo)致治療失敗。5-FU在體內(nèi)大部分經(jīng)過二氫嘧啶脫氫酶(DPD)代謝失活，少部分是經(jīng)過胸苷磷酸化酶(TP)代謝成其活性代謝產(chǎn)物2’-脫氧-5-氟尿嘧啶磷酸鹽(2’-dFUMP)。除5-FU外，氟化嘧啶類藥物如卡培他濱、替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脫氧氟尿苷等，是5-FU的前藥，需在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成5-FU起抗腫瘤作用。

二氫嘧啶脫氫酶是5-FU催化代謝限速酶，85%的5-FU經(jīng)其代謝成非活性代謝產(chǎn)物。因此，遺傳導(dǎo)致的酶活性不足，可導(dǎo)致代謝改變和嚴(yán)重藥物毒性反應(yīng)。二氫嘧啶脫氫酶編碼的基因是DPYD，為人1p22染色體上，長950bp，有23個外顯子。至今已發(fā)現(xiàn)超過30種SNPs和缺失突變，大多數(shù)對DPD酶功能無影響，少部分使酶活性降低，甚至導(dǎo)致酶功能缺失。最常見的可導(dǎo)致嚴(yán)重毒性反應(yīng)的突變是14外顯子1986位A→G改變(DPYD*2A等位基因，rs3918290)，其編碼的產(chǎn)物為無活性的酶。酶活性嚴(yán)重降低，導(dǎo)致5-氟尿嘧啶在體內(nèi)蓄積，引起嚴(yán)重粘膜炎、粒細(xì)胞減少癥、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀甚至死亡。大量研究表明，DPD酶活性降低的患者中有40%攜帶DPYD*2A基因突變，其中有60%的患者5-FU治療后發(fā)生4級嚴(yán)重的粒細(xì)胞減少血液毒性。DPD酶活性正常患者經(jīng)5-FU治療后只有10%發(fā)生嚴(yán)重毒副反應(yīng)。因此，DPD基因分型可能是一種預(yù)測5-FU治療導(dǎo)致致命毒性反應(yīng)發(fā)生概率的有效遺傳分析手段，為臨床醫(yī)生制定藥物治療方案提供參考。?

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，它將5，10-MTHF轉(zhuǎn)變成5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)。葉酸抑制劑(5-氟尿嘧啶、培美曲塞、卡培他濱、替加氟等)的抗癌活性與腫瘤細(xì)胞內(nèi)5，10-亞甲基四氫葉酸濃度呈正相關(guān)。因此，MTHFR的活性將直接影響體內(nèi)5，10-MTHF的濃度，從而影響葉酸抑制劑的抗癌作用。MTHFR基因位于l號染色體，具有多態(tài)性，最常見的突變是位于4號外顯子的rs1801133。rs1801133發(fā)生頻率較高，普通人群AA突變純合子發(fā)生率為25%。具有AA型突變等位基因的患者，MTHFR酶活性的下降使得細(xì)胞內(nèi)亞甲基四氫葉酸積聚，增強了5-FU活性代謝產(chǎn)物5-FdUMP對胸苷酸合成酶的抑制作用，導(dǎo)致了嚴(yán)重的骨髓抑制不良反應(yīng)。有研究表明，5-FU治療后，AA型患者77%產(chǎn)生了3-4級毒性反應(yīng)，GA和GG型患者出現(xiàn)這種毒性反應(yīng)的只有6%和8%，突變純合子產(chǎn)生毒性反應(yīng)的概率是其它基因型的9到12倍。因此，MTHFR是也是預(yù)測5-FU療效的因子。

綜上所述，DPYD和MTHFR基因多態(tài)性是影響抗葉酸類制劑需求劑量差異性的主要因素，開發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟的檢測DPYD和MTHFR基因多態(tài)性的試劑盒將為抗葉酸類制劑的臨床個體化治療起到積極的推動作用。

焦磷酸測序(Pyro?sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無須進(jìn)行電泳，DNA片段也無須熒光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺。該技術(shù)具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發(fā)明內(nèi)容

DPYD?(rs3918290)和MTHFR?(rs1801133)基因多態(tài)性是影響抗葉酸類制劑劑量個體差異的最主要因素。本發(fā)明提供一種檢測影響臨床抗葉酸類制劑個體化用藥治療的用藥基因DPYD（SEQ?ID?NO.1）和MTHFR（SEQ?ID?NO.2）多態(tài)性的試劑盒及方法，以實現(xiàn)快速、簡便、準(zhǔn)確、高效、實用、經(jīng)濟的檢測抗葉酸類制劑個體化用藥相關(guān)基因SNP。

????為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

所述焦磷酸測序法檢測抗葉酸類制劑個體化用藥基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物：

（1）????擴增引物：

????DPYD?(rs3918290)上游引物：5’-?GGT?GTC?AAA?GTG?TCA?CTG?AAC?TA?-3’（SEQ?ID?NO.3）；

????MTHFR?(rs1801133)?上游引物：5’-?AAG?GCC?ACC?CCG?AAG?CAG?GGA?GCT?-3’（SEQ?ID?NO.4）；