[發明專利]焦磷酸測序法檢測CYP1B1基因多態性的試劑盒及方法

無效

• 申請號: 201210230456.8
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN102796813A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發明（設計）人: 周宏灝
• 申請（專利權）人: 周宏灝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及焦磷酸測序法檢測CYP1B1基因多態性的試劑盒及方法。

背景技術

抗微管類藥物的抗癌譜很廣，使用最為廣泛的化療藥之一。紫杉醇參與微管蛋白的聚合，生成微管相關蛋白，使微管蛋白亞單位的分子量增至60～76kDa。經紫杉醇作用后的微管其形態發生改變，不與染色體連接，使細胞表面出現突起，并抑制有絲分裂，從發揮抗腫瘤的作用。腫瘤細胞G2晚期和M期較為敏感。常用的藥物有紫杉醇、多西紫杉醇、長春堿、長春新堿和長春瑞濱等。紫杉醇治療卵巢癌、乳腺癌有良好效果，對治療前列腺癌、上消化道癌、小細胞性和非小細胞性肺癌前景良好。

CYP1B1是一種在許多與激素相關的腫瘤組織中特異性高表達的CYP450酶，可導致多西紫杉醇等抗腫瘤藥物代謝失活，產生耐藥。CYP1B1?C4326G突變導致CYP1B1?mRNA和蛋白表達增加，從而使紫杉醇類藥物療效降低。在乳腺癌患者接受紫杉醇/多柔比星治療中，以100個月為觀察終點，突變患者（Leu432Val，Val432Val）中位生存期為30個月，而野生型患者(Leu432Leu)的中位生存期仍未達到(P＝0.037)。

綜上所述，CYP1B1基因多態性可作為紫杉醇類化療藥物等的療效預測的有效指標，開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測CYP1B1基因多態性的試劑盒將為CYP1B1底物藥(如紫杉醇類化療藥物等)的臨床個體化治療起到積極的推動作用。

焦磷酸測序(Pyro?sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種???通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發明內容

本發明旨在提供一種焦磷酸測序法檢測CYP1B1基因（SEQ?ID?NO.1）多態性的試劑盒及方法，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測CYP1B1基因多態性，利于臨床個體化使用CYP1B1的底物藥(如紫杉醇類化療藥物等)。

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：

所述焦磷酸測序發檢測CYP1B1基因多態性的試劑盒，包括如下引物：

（1）擴增引物：

?????上游引物：5’-GCG?CTT?CTC?CAG?CTT?TGT?GCC?T-3’（SEQ?ID?NO.2）；

?????下游引物：5’-AGG?TCC?TTG?TTG?ATG?AGG?CCA-3’（SEQ?ID?NO.3）；

其中，下游引物的5’進行生物素標記；

（2）測序引物：5’-GGT?CTG?TGA?ATC?ATG?ACC-3’（SEQ?ID?NO.4）；

在實際應用中，可以對上述引物作適當改變，只要保證設計的引物與上述引物同源性達95%以上即可；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑。

所述應用上述試劑盒檢測CYP1B1基因多態性的方法，包括如下步驟：

（1）DNA提取；

（2）聚合酶鏈反應：

配制50μl?PCR擴增體系，包含：10×PCR?buffer?5.0μl，dNTP?1.5μl，CYP1B1-上游引物?0.5μl，CYP1B1下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水40μl，模板2μl；循環程序為：95?℃5min預變性；依次在95^oC?30S，50^oC?30S，72^oC?30S，進行35個循環；72^oC?保持5min，最終保持在4?℃，得擴增產物；

（3）焦磷酸測序單鏈樣本純化；

（4）焦磷酸測序及結果分析。

本發明的試劑盒對CYP1B1?rs1056836?(C>G)目標序列，該目標序列包括：野生型CACTGAA（SEQ?ID?NO.5）和突變型CAGTGAA（SEQ?ID?NO.6）；擴增出的片段長為201bp。

由于設計了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發明的試劑盒能夠對CYP1B1基因多態性進行快速檢測，可廣泛應用于臨床上紫杉醇類化療藥物等個體化用藥方案制定的基因檢測。與現有技術相比，其應用焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便于構建標準化操作流程；具有高通量、低成本等特點；PCR產物即可直接用于測序，不需進行產物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。

附圖說明