[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于EST數(shù)據(jù)挖掘的抗病基因同源物的標(biāo)記方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210230401.7
• 申請(qǐng)日: 2012-07-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102747154A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林忠旭;張獻(xiàn)龍;任高峰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;G06F19/24
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏峰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于棉花抗病育種技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種基于EST數(shù)據(jù)挖掘的抗病基因同源物（Resistance?genes?homologues,RGHs）的標(biāo)記方法，方法易行,操作簡(jiǎn)便，能夠高效的用于植物抗病育種，縮短了育種時(shí)間，并降低了費(fèi)用。?

背景技術(shù)

作物生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到多種病蟲(chóng)害的危害，導(dǎo)致產(chǎn)量或品質(zhì)下降。通過(guò)分子育種培育抗病品種對(duì)于減輕病害危害、保證高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)以及減小農(nóng)藥使用量等方面起很重要的作用。?

除了已完成基因組測(cè)序的少數(shù)作物如水稻、玉米等之外，大部分農(nóng)作物抗病研究基礎(chǔ)薄弱或存在一些天然的弱勢(shì)。某些作物基因組龐大且重復(fù)序列多，又或者多態(tài)性比率較低，難以構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜，導(dǎo)致難以找到與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記；針對(duì)抗病材料構(gòu)建遺傳圖譜，或利用關(guān)聯(lián)分析或連鎖分析方法等篩選大量種質(zhì)資源獲取抗性材料等，又可能涉及費(fèi)用過(guò)高或工作量較大的問(wèn)題。開(kāi)發(fā)與作物抗病基因或性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，才能夠降低這些作物抗病育種的難度與費(fèi)用。?

廣義上的植物抗病基因同源物包括防御基因類(lèi)似物與抗病基因類(lèi)似物（Resistance?gene?analogs，RGA）。病程相關(guān)蛋白屬于防御基因一類(lèi)，在植物收到生物或非生物脅迫時(shí)表達(dá)，一般參與植物廣譜抗性。其作用機(jī)理主要有三種：一是加固細(xì)胞壁、自我保護(hù)；二是抑制真菌、細(xì)菌生長(zhǎng)或病毒復(fù)制；三是合成植物抗毒素和細(xì)胞內(nèi)毒素。抗病基因通過(guò)與病原物非親和因子相互作用，最終激活抗病反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)；或者與病原物親和因子相互作用，使親和性因子失活而失去病害誘發(fā)作用。一般抗病基因一般對(duì)不同病原物具有特異抗性。?

RGA可能是植物抗病基因或其假基因的一部分，通過(guò)水稻、擬南芥等基因組RGA物理圖譜定位，發(fā)現(xiàn)RGA常成簇存在且簇內(nèi)成員包含有植物抗病基因。這個(gè)特性導(dǎo)致RGA標(biāo)記與抗病基因連鎖的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于隨機(jī)標(biāo)記，能夠高效的用于植物抗病性與分子標(biāo)記的連鎖分析，進(jìn)而克隆植物抗病基因或進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種。并且由于RGA屬于快速演化序列，能夠高效用于抗性種質(zhì)資源多樣性研究。Collins利用用與玉米抗銹病基因Rp1-D連鎖的R基因同源序列pic20為探針，從基因組文庫(kù)中篩選到含有Rp1-D基因的克隆。Wang利用大豆R為混合探針，從大豆cDNA文庫(kù)篩選得到一個(gè)受外源水楊酸誘導(dǎo)表達(dá)的全長(zhǎng)基因KR3。?

大部分RGH（Resistance?genes?homologues）都是利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)展基因組DNA得到的，擴(kuò)展后一般需要挑選單克隆進(jìn)行測(cè)序。由于大量假基因的干擾，這些RGHs不太可能是功能基因。如果使用cDNA為模板，隨機(jī)挑選克隆時(shí)高量表達(dá)的RGHs也很容易覆蓋掉微量表達(dá)的RGHs。大部分的簡(jiǎn)并引物都是利用數(shù)目有限的幾個(gè)基序（motif）來(lái)設(shè)計(jì)引物，導(dǎo)致只有幾個(gè)保守域可以被擴(kuò)增。如許多簡(jiǎn)并引物都是基于R基因NBS區(qū)域的P-loop、Kinase2、Kinase3a和GLPLAL等設(shè)計(jì)的引物，則擴(kuò)增產(chǎn)物也只能包括NBS區(qū)域，無(wú)很難獲取NBS側(cè)翼序列。一些不適于設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的基因也較難得到同源序列。?

而利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘RGHs則可以部分克服這些問(wèn)題。數(shù)據(jù)挖掘無(wú)需經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)展與挑選大量單克隆測(cè)序的過(guò)程，EST來(lái)源RGHs更加可能為功能基因而且海量數(shù)據(jù)可以克服表達(dá)量水平不同造成的影響。對(duì)于全基因組測(cè)序完成的物種，利用數(shù)據(jù)挖掘的方法可以得到全基因組范圍內(nèi)的所有RGHs。利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘的RGHs的多樣性也比利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增更加豐富。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供了一種基于EST(Expressed?Sequence?Tag)數(shù)據(jù)挖掘的抗病基因同源物（Resistance?genes?homologues,RGHs）的標(biāo)記方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，能夠高效的用于植物抗病育種，縮短了育種時(shí)間，并降低了費(fèi)用。?

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：?

本發(fā)明通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘方法獲取抗病基因同源物并將其轉(zhuǎn)化為分子標(biāo)記的方法，能夠大大加快植物抗病育種進(jìn)程。?

一種基于EST數(shù)據(jù)挖掘的抗病基因同源物的標(biāo)記方法，其步驟是：

（1）病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related?protein,PRP）序列挖掘及引物設(shè)計(jì):?