[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于EST數(shù)據(jù)挖掘的抗病基因同源物的標(biāo)記方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210230401.7
• 申請(qǐng)日: 2012-07-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102747154A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林忠旭;張獻(xiàn)龍;任高峰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;G06F19/24
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏峰

1.一種基于EST數(shù)據(jù)挖掘的抗病基因同源物的標(biāo)記方法，其步驟是：

（1）序列挖掘及引物設(shè)計(jì):

陸地棉EST序列下載,使用獲取PR序列,引物設(shè)計(jì)使用Primer-BLAST，參數(shù)設(shè)置為：退火溫度55-60℃，PCR產(chǎn)物大小100-500bp，引物長(zhǎng)度設(shè)置為20bp;

（2）RGA序列挖掘及引物設(shè)計(jì):

通過(guò)文獻(xiàn)收集96條不同物種的R蛋白序列，同時(shí)下載擬南芥中196條R蛋白序列,從TIGR中下載3個(gè)棉種的EST數(shù)據(jù),使用本地tBLASTn?進(jìn)行比對(duì)，E值設(shè)置為10^-10,以相似性≥40%?為閾值初步挑出序列，將核酸序列轉(zhuǎn)換為蛋白序列后使用NCBI提供的Conserved?Domain?Search工具分析其保守域,包含抗病相關(guān)保守域的序列被列為RGA,挑出的PK類(lèi)序列會(huì)再次與R蛋白進(jìn)行比對(duì)，只有相似性≥75%才被認(rèn)定為RGA,在包含內(nèi)含子區(qū)域兩側(cè)設(shè)計(jì)了引物，命名規(guī)則為序列ID+RGA-ILP;

（3）對(duì)開(kāi)發(fā)的標(biāo)記進(jìn)行遺傳定位:

所用的海陸種間BC₁群體,然后在單鏈構(gòu)象多態(tài)性電泳條件下利用親本鄂棉22和3-79篩選多態(tài)性,篩選出的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)BC₁群體進(jìn)行多態(tài)性分析，數(shù)據(jù)導(dǎo)入JoinMap3.0?構(gòu)建遺傳圖譜，Mapchart?2.2?軟件繪制遺傳連鎖圖譜;

（4）半定量RT-PCR驗(yàn)證表達(dá):

海島棉3-79和陸地棉鄂棉22采用蛭石種于溫室內(nèi)，兩葉一心期幼苗時(shí)用黃萎病病菌V991進(jìn)行沾根法誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后0、?6、24、48、72和96小時(shí)取根部樣品，提取RNA反轉(zhuǎn)為cDNA后用于半定量RT-PCR驗(yàn)證。