[發明專利]斑點叉尾鮰病毒現場快速檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201210229899.5
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN102703609A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 張慶利;黃倢;閻毅;史成銀;王勤濤;劉莉
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;曾慶國

技術領域

本發明屬于水產動物病原檢測技術領域，具體涉及一種斑點叉尾鮰病毒（Channel?Catfish?Virus，簡稱CCV）的現場快速高靈敏檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

斑點叉尾鮰病毒是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒，含囊膜的完整病毒粒子直徑為175nm～200nm；其核衣殼為二十面體，直徑90nm～105nm。該病毒又稱鲴魚皰疹病毒I型（Ictaluridherpes?virus?I），國際病毒分類委員會（ICTV）第八次報告的最新病毒分類系統將其歸類為皰疹病毒科（Herpes?virus）、鲴魚皰疹病毒屬（Ictaluri?virus）。研究發現，該病毒主要感染斑點叉尾鲴和鲴魚兩種經濟魚類，患病魚發病時表現出水腫、眼突出、鰭條和肌肉出血等癥狀，組織病理學變化為腎管和腎間組織廣泛壞死。該病毒引起的斑點叉尾鲴病毒病（Channel?Catfish?Virus?disease，CCVD）是一種嚴重的、急性致死性傳染病，最先報道于美國，目前主要在北美地區流行，其傳播速度快、死亡率高，一旦發病就會給斑點叉尾鲴養殖帶來嚴重的經濟損失。斑點叉尾鲴在國內的養殖始于上世紀80年代，因養殖效益高，目前已成為我國重要的水產養殖經濟魚類之一；隨著養殖規模的擴大以和養殖密度的增加，養殖期間大規模爆發斑點叉尾鮰病毒病的風險也大大增加了。所以研究并建立CCV的快速檢測預警技術，加強斑點叉尾鮰苗種和成魚類檢疫以及養殖水體環境的監測，對預防病毒感染，有效切斷病毒傳播，保障我國斑點叉尾鮰養殖業的健康持續發展就顯得尤為迫切和重要。

目前，CCV檢測還主要依賴于病毒分離培養、病理切片法、電鏡觀察法、抗體雜交和PCR檢測法。病毒分離培養法需要專門的培養條件及細胞系并且耗時較長，不適于進行預警監測；病理切片法不能直接對病毒進行檢測，只能利用發病的組織病理征兆進行檢測，并且還局限于在實驗室內進行；電子顯微鏡技術雖然可以直接觀察到病毒粒子的存在，但其操作復雜、耗費時間長、準確性低；用抗體雜交檢測法檢測CCV雖然在速度上優于病理切片法，但其靈敏度較低，在CCV尚未引發感染或感染的極早期很難用抗體法檢測出來；CCV的PCR檢測法，雖然克服了前面幾種方法的缺點，在實驗室條件下能實現對CCV的相對快速、準確檢測，但由于常規的PCR檢測需要昂貴的PCR儀、凝膠電泳和成像系統，使得PCR檢測法難以用于現場的快速檢測，這大大限制了PCR檢測方法在生產中的推廣應用。

進行斑點叉尾鮰病毒早期檢測并采取預防措施是水產養殖中降低斑點叉尾鮰病毒流行風險、減少發病照成巨額經濟損失的有效手段，所以建立簡單、快速、高靈敏的檢查方法，并開發適于現場應用的斑點叉尾鮰病毒檢測試劑盒就尤為必要。

發明內容

本發明的目的是提供一種斑點叉尾鮰病毒現場快速檢測試劑盒及檢測方法，即適于生產現場應用、快速、高靈敏度且易操作的斑點叉尾鮰病毒檢測方法，并將檢測方法標準化，同時將檢測試劑集中于規范的試劑盒中，以克服現有技術的不足，使CCV的檢測更準確、靈敏、快速、安全和方便。

本發明一個方面是提供用于檢測斑點叉尾鮰病毒的引物組，其核苷酸序列分別為SEQ?ID?NO：1-4；具體信息如下：

上游引物1?SEQ?ID?NO：1：

5'-AGGGAGGTCACCACGAGCATTTTGTCGCGGACAGGGTCATG-3’

下游引物1?SEQ?ID?NO：2：

5'-TCGCCCTCTGGGTGATCGTTTTTGGGATCTCTCGTGGGGAATG-3’

上游引物2?SEQ?ID?NO：3：5'-GAGATCGCCATCGGTTCG-3’

下游引物2?SEQ?ID?NO：4：5'-ACCGGGGCTCCAGTCT-3’。

本發明的另一個方面提供一種用于檢測斑點叉尾鮰病毒的試劑盒，包括如下的組分：

（1）采樣管，用來盛放、研磨待檢樣品；

（2）漂洗管，內裝蒸餾水；

（3）核酸變性管，內裝TE緩沖液；