[發明專利]斑點叉尾鮰病毒現場快速檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201210229899.5
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN102703609A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 張慶利;黃倢;閻毅;史成銀;王勤濤;劉莉
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南;曾慶國

1.一種用于檢測斑點叉尾鮰病毒的引物組，其特征在于，引物的核苷酸序列分別為SEQ?ID?NO：1-4。

2.一種用于檢測斑點叉尾鮰病毒的試劑盒，包括如下的組分：

（1）采樣管，用來盛放、研磨待檢樣品；

（2）漂洗管，內裝蒸餾水；

（3）核酸變性管，內裝TE緩沖液；

（4）擴增檢測管，內裝擴增反應液和染料，擴增反應液組成成分如下：擴增引物的上游引物1和下游引物1各1～2μM，擴增引物的上游引物2和下游引物2各0.1～0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.0mM，MgCl₂?4～10mM，Betaine?0.6～1.2M，Tris-HCl?10～40mM，KCl?10～20mM，MgSO₄?1～4mM，(NH₄)₂SO₄?6～12mM，Triton?X-100?0.05%～1.0%，Bst?DNA聚合酶2～25U；

（5）陰性對照管，內裝無斑點叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；

（6）陽性對照管，內裝吸附了斑點叉尾鮰病毒核酸的FTA膜片；

（7）快速干燥液，為親水性且易揮發的醇類物質；

（8）分別封裝于無菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙簽和吸管；

其中的上游引物1和下游引物1、上游引物2和下游引物2為權利要求1所述的引物組，其序列信息如下：

上游引物1的序列為SEQ?ID?NO：1；

下游引物1的序列為SEQ?ID?NO：2；

上游引物2的序列為SEQ?ID?NO：3；

下游引物2的序列為SEQ?ID?NO：4。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的組分（4）擴增檢測管中的染料為鈣黃綠素與金屬離子形成的配合物。

4.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的組分（4）擴增檢測管中的染料為分子生物學中應用的核酸染料。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的核酸染料為SYBR?Green、GelRed、GelGreen、GoldView^TM或GeneFinder^TM中的任一種。

6.如權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的FTA膜片是由英國Whatman公司用來制備核酸的FTA卡片裁切成的尺度不小于1平方毫米的紙片。

7.權利要求2所述的試劑盒的用途，其特征在于，是用于非疾病和治療目的的斑點叉尾鮰病毒的檢測。

8.如權利要求7所述的試劑盒的用途，其特征在于是對飼料和養殖水體進行斑點叉尾鮰病毒的檢測。

9.如權利要求7所述的試劑盒的用途，其特征在于，是按下列步驟進行的：

（1）取樣品組織約0.02～1.0g置于采樣管中，用研磨棒將樣品組織磨碎至漿狀；

（2）用研磨棒蘸取漿狀的樣品組織將FTA膜片充分潤濕；

（3）吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，靜置1~20min；

（4）用牙簽將上述FTA膜片轉移到漂洗管內，震蕩漂洗3~5min以洗滌FTA膜片；

（5）再用牙簽將上述核酸變性管內的FTA膜片轉移到擴增檢測管內，將擴增檢測管置于55～65°C條件下保溫40～70min；

（6）將擴增檢測管上下反復甩動1-3min；

（7）用力向下甩動擴增檢測管，使管內混有染料的擴增反應液集聚于擴增檢測管底部，用眼睛觀察反應液，如果反應液呈現綠色則表示該樣品的CCV檢測結果為陽性，如果反應液呈現橙黃色則表示該樣品的CCV檢測結果為陰性。