[發明專利]一種利用堿蓬細胞懸浮培養生產脯氨酸的方法

無效

• 申請號: 201210229844.4
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN102719503A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 李興林;周鑫;韓楊;曹愛佳;崔興華;王丹丹;趙俊;滿淑麗;張黎明;高文遠
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12P13/24
• 分類號: C12P13/24;C12N5/04;C12N5/02;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明專利屬于生物技術和生物工程領域。

背景技術

利用微生物發酵工程生產脯氨酸是目前較常用的一種方法。經過多年的研發，脯氨酸產量有所提高，但進一步提升，難度會越來越大。為探究脯氨酸生產新途徑，本發明，以鹽地堿蓬為發酵生物，利用細胞懸浮培養大規模生產脯氨酸就是本發明的目的。

為了利用植物懸浮細胞培養工業化生產脯氨酸，本實驗以鹽地堿蓬為研究對象，應用單因素試驗和主要因子的正交試驗等方法對鹽地堿蓬的愈傷組織誘導、懸浮體系建立和細胞懸浮培養基和培養條件優化等方面進行了研究。

發明內容

1消毒種子、無菌培養制備堿蓬無菌苗；

2以無菌堿蓬的子葉為外植體在脫分化培養基中誘導愈傷組織；愈傷組織經過多次固體培養基的繼代培養獲得更為松散的愈傷組織；

3松散型愈傷組織經液體培養基在無菌條件下振蕩培養制備懸浮細胞體系；過篩后液體培養基中繼代培養獲得穩定的懸浮細胞系；

4經愈傷組織誘導的看護培養篩選出快速生長的細胞系；繼續進行細胞的懸浮培養獲得發酵種子細胞；

5確定堿蓬懸浮細胞積累脯氨酸的NaCl添加時期和添加量等；

6堿蓬的懸浮培養基和培養條件的優化，獲得植物細胞生長和產物積累的最適碳氮源、pH、溫度、溶氧量、和最佳接種量等發酵工藝參數，為大規模堿蓬細胞懸浮培養生產脯氨酸奠定基礎。

主要用途

本發明專利，通過細胞脫分化和發酵工程途徑，利用堿蓬細胞的大規模懸浮培養生產脯氨酸。

具體實施方式

1制備無菌苗

選取無病植株，在冬季采摘其種子；用無菌水清洗種子后，分別用質量百分比為70％酒精和10％次氯酸鈉消毒1min和15min，再用無菌水多次清洗；將種子接種在滅菌的MS培養基中，在自然光照、室溫、無菌條件下培養5～20天，獲得無菌苗。

2愈傷組織的誘導

切下無菌苗的子葉，將子葉切成0.5cm長的小片段接種到含有植物激素組合(2，4-D1mg/L和6-BA0.5mg/L)的培養基中，其光照條件為光照16小時、黑暗8小時，光照強度約200～1000μmol/m/s，在室溫下培養20天左右；在形成的愈傷組織中，選擇顏色為白色或淡黃色、質地較為松散的愈傷組織，在含同樣植物激素組合的新的的培養基中進行繼代培養，直到獲得生長旺盛、松散良好的愈傷組織為止。

3制備懸浮細胞

將松散型愈傷組織置入含植物激素液體MS培養基中：2，4-D0.1～4mg/L和6-BA0.1～2.0mg/L或KT0.1～1.0mg/L，振蕩、光照培養10～15天；考察細胞密度、脯氨酸含量和還原糖消耗量。結果表明，2，4-D1.0mg/L和6-BA或KT0.1mg/L的激素組合細胞密度和脯氨酸含量最高。液體培養基經3次繼代培養，接種時間為5～10天；生長穩定期的細胞或小細胞團分散度均勻穩定，細胞密度每毫升達到3×10⁶個。

4高產細胞系篩選

利用無菌苗的子葉制備新鮮堿蓬愈傷組織，繼代1次；在第二次繼代培養第6天時，用滅菌鑷子將密布的愈傷組織弄平；然后輕輕在其表面覆蓋滅菌的濾紙；最后將密度已稀釋到每毫升1×10³個的懸浮細胞涂布在濾紙表面進行培養；通過比較小愈傷組織的大小和形態篩選出快速生長的細胞系；繼續進行細胞懸浮培養獲得發酵種子細胞；其時，獲得的20個細胞系，其懸浮細胞生長曲線表明，生長周期平均為15.6天，細胞倍增時間平均為11個小時。

5培養基中NaCl添加時期和添加量的確定

采用完全設計手段，在高產細胞系懸浮培養基中和不同培養時間添加0～2.5％NaCl，通過制備的細胞干重生長曲線和脯氨酸含量變化曲線以確定堿蓬細胞懸培養基的NaCl添加時期和添加量等。結果表明，當初始階段NaCl添加量為0.5％時，細胞干重最高；后期的添加量為2.0％時，脯氨酸的積累濃度達到最高值，為2516.32μg/mL，為對照的2倍以上。

6懸浮細胞培養基和培養條件優化