[發明專利]一種干涉膨脹素基因Exp2制備植物懸浮培養小細胞系的方法

無效

• 申請號: 201210229725.9
• 申請日: 2012-07-05
• 公開（公告）號: CN102839155A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 李興林;肖天劍;韓楊;曹愛佳;高潔;張黎明;趙俊;滿淑麗;高文遠
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/02;C12N15/82;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明專利屬于生物技術領域。

背景技術

細胞懸浮培養是生產植物次生代謝物的重要手段之一。但是，植物懸浮細胞生長速度緩慢、培養周期長成了細胞懸浮培養的環節多、成本高等關鍵問題。本發明利用RNAi原理，通過降低植物Exp2基因的表達，以達到縮短植物懸浮細胞培養周期、提高細胞培養密度目的。

發明內容

構建植物細胞表達載體。

通過比對Genbank注冊的植物Exp2基因的核苷酸序列，選定其兩個保守區各30-100個堿基對的核苷酸序列分別為正向片段I和II，并以其為依據分別設置其對應的反向序列(I’和II’)；根據兩對正、反序列設計出合適的引物，在PCR擴增過程中，使正反片段分別引入限制性內切酶位點(EcoR?I和Hind?III)和相應的GU-AG內含子端部序列。經過酶切、再連接、轉化、克隆和鑒定后，得到了四片段的I-AC-II’-II-CT-I’序列產物；該產物插入到pCAMBIA2300植物表達載體，導入農桿菌感受態EHA105，篩選出能轉化植物的工程菌。

以甘草為例獲得甘草轉化體。

從甘草幼苗的上胚軸上誘導愈傷組織；早期愈傷組織與農桿菌工程菌共培養；隨后在含抗生素的培養基中進行選擇培養，篩選出抗性愈傷組織并進行繼代培養；將松散的抗性愈傷組織在液體培養基振蕩培養；培養物過篩后繼續進行懸浮培養，獲得穩定的懸浮細胞。

高產懸浮細胞系的篩選。

利用看護培養手段，從懸浮細胞中篩選生長速度快的單細胞系愈傷組織；將該愈傷組織在液體培養基中振蕩培養；培養物過篩后繼續進行懸浮培養，獲得由單細胞和小細胞團組成的懸浮系；對該懸浮系的細胞生長周期、主要代謝產物含量進行等鑒定并穩定性試驗，獲得的生長懸浮細胞作為種子進入大規模。

細胞懸浮培養基及培養條件的優化。

通過培養基和培養條件的優化，獲得植物細胞生長和產物積累的最適碳氮源、pH、溫度、溶氧量和最佳接種量等發酵工藝參數，為進一步進行大規模細胞懸浮培養提供了依據。

主要用途

利用本發明方法獲得的培養周期短、成本低、生產效率高的細胞，將在大規模開發和生產藥用植物有效成分方面將發揮著關鍵作用。

具體實施方式

以甘草為例-干涉膨脹素基因Exp2制備甘草懸浮培養小細胞系的方法

構建植物細胞表達載體

通過Genbank注冊的所有植物膨脹素基因的核苷酸序列，選定其兩個保守區各50個堿基對的核苷酸序列分別為正向片段I和II，并以其為依據分別設置其對應的反向序列(I’和II’)；根據兩對正、反序列設計出合適的引物，在PCR擴增過程中，使正反片段分別引入限制性內切酶位點(EcoR?I和Hind?III)和相應的GU-AG類內含子端部核苷酸序列。結果見表1。經過酶切、再連接、轉化、克隆和鑒定后，得到了四片段的I-AC-II’-II-CT-I’序列產物；該產物插入到pCAMBIA2300植物表達載體，導入感受態農桿菌EHA105，篩選出能轉化植物細胞的工程菌pCAM-RNAi-Exp。

表1膨脹素基因兩個保守片段及其PCR引物的核苷酸序列

注：表的框中和下劃線上核苷酸為非膨脹素基因的核苷酸序列。

獲得甘草細胞轉化體

從甘草幼苗的上胚軸上誘導愈傷組織；早期愈傷組織與農桿菌工程菌EHA105共培養；隨后在含抗生素的培養基中進行選擇培養；對形成的抗性愈傷組織進行GUS組織化學染色、抗性基因的PCR鑒定，結果見表2；對鑒定陽性的愈傷組織進行繼代培養2-5次直至形成松散型愈傷組織；將松散的抗性愈傷組織在液體培養基中振蕩培養；培養物過篩后繼續進行懸浮培養，獲得穩定的懸浮細胞系；對形成的懸浮細胞進行報告基因gus蛋白的組織化學染色、抗生素抗性基因的PCR鑒定，以確定其是否為轉化的懸浮細胞系。

表2不同濃度工程農桿菌對甘草愈傷組織轉化率的影響

篩選甘草酸高產懸浮細胞系