[發(fā)明專利]一種干涉膨脹素基因Exp2制備植物懸浮培養(yǎng)小細(xì)胞系的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210229725.9
• 申請(qǐng)日: 2012-07-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102839155A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李興林;肖天劍;韓楊;曹愛(ài)佳;高潔;張黎明;趙俊;滿淑麗;高文遠(yuǎn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N5/02;C12N15/82;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

一種干涉膨脹素基因Exp2制備植物懸浮培養(yǎng)小細(xì)胞系的方法。其特征是：

1.構(gòu)建膨脹素基因Exp2的RNAi表達(dá)載體工程菌。利用Genbank報(bào)道的膨脹素基因核苷酸序列，選擇兩段保守性較高的核苷酸區(qū)域分別作為正向片段(I和II)，并以其為依據(jù)分別設(shè)置其對(duì)應(yīng)的反向序列(I’和II’)，通過(guò)比對(duì)Genbank注冊(cè)的植物膨脹素基因Exp2的核苷酸序列，選定其兩個(gè)保守區(qū)分別為正向片段I、II以及對(duì)應(yīng)的反向序列I’和II’；構(gòu)建I-AC-II’-II-CT-I’的RNAi片段；篩選出插在pCAMBIA2300表達(dá)載體并能轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的工程菌。

2.從外植體誘導(dǎo)早期愈傷組織；早期愈傷組織與根瘤農(nóng)桿菌工程菌共培養(yǎng)；隨后在含抗生素的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，篩選出抗性愈傷組織并進(jìn)行繼代培養(yǎng)；將松散的抗性愈傷組織在液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)物過(guò)篩后繼續(xù)進(jìn)行振蕩懸浮培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系。

3.利用看護(hù)培養(yǎng)手段，從懸浮細(xì)胞中篩選生長(zhǎng)速度快的單細(xì)胞系愈傷組織；將該愈傷組織在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)物過(guò)篩后繼續(xù)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得由單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)組成的懸浮系；對(duì)該懸浮系的細(xì)胞形態(tài)大小、生長(zhǎng)周期、主要代謝產(chǎn)物含量及其穩(wěn)定性等進(jìn)行鑒定，最后獲得的懸浮細(xì)胞作為種子進(jìn)入大規(guī)模培養(yǎng)。

4.通過(guò)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，獲得植物細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累的最適碳氮源、pH、溫度、溶氧量和最佳接種量等主要發(fā)酵工藝參數(shù)。