[發明專利]矮牽牛離體莖尖的超低溫保存方法

有效

• 申請號: 201210229180.1
• 申請日: 2012-07-03
• 公開（公告）號: CN102726298A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 陳曉玲;黃斌;張金梅;盧新雄;辛霞
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N3/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及植物種質資源的超低溫保存方法，具體地說，涉及一種矮牽牛離體莖尖的超低溫保存方法。

背景技術

矮牽牛（Petunia×hybrida?Vilm.），別名靈芝牡丹、碧冬茄、撞羽朝顏等，為茄科（Solanaceae）矮牽牛屬花卉。矮牽牛為多年生草本雙子葉植物，常作一、二年生栽培，株高15~80cm不等；葉片呈現橢圓或卵圓狀；營養生長期短，當年可開花，花期可長達數月之久；花冠呈現喇叭狀（類似牽牛花）；花瓣邊緣類型有平瓣、波狀瓣、鋸齒瓣等；花色有紫、紅、白、粉及鑲嵌、網紋、條紋等；果實為尖圓形蒴果，種子極小，千粒重約0.1g（費硯良,劉青林,葛紅等.中國作物及其野生近緣植物,花卉卷[M].中國農業出版社,2008:505-508）。

矮牽牛原產于南美洲的阿根廷，目前在世界各國均廣泛種植，如日本、意大利、法國、西班牙、荷蘭和德國等，用于道路街邊綠化和庭園美化；在美國，矮牽牛的種植面積和消費額高居草本花卉之首；在日本，矮牽牛也被評為最受歡迎的草本花卉之一。矮牽牛廣泛應用于花壇、花境布置，窗臺和庭院裝點，另外大花、重瓣的品種也是切花的材料。

矮牽牛種子常規保存壽命3-5年，發芽率60%左右，染色體倍數為2X、4X、5X（X=7）類型。矮牽牛品種在種植時退化現象嚴重，很多品種只能通過無性繁殖保存種質。我國目前矮牽牛種子多為國外進口的雜交種，其價格十分高昂，雖可以采用扦插繁殖，但其成活率低，但是實際生產中需要大量的種苗，很難在短時間內提供大量的繁殖體。

目前，有關矮牽牛的種質保存方面的研究報道較少。超低溫保存技術是可長期安全保存種質資源的可選擇的較佳途徑之一，不但節約空間，而且成本低。現已開發出多種超低溫保存方法，然而針對不同物種甚至對于同一物種的不同栽培品種，其適宜的超低溫保存方法及程序技術都有可能不同，迄今為止，國際上尚未建立起具有普適性的超低溫保存方法，這也是超低溫保存技術實際應用中的一個主要瓶頸。

發明內容

本發明的目的是提供一種矮牽牛試管苗離體莖尖小滴玻璃化法超低溫保存技術及植株再生培養方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種矮牽牛離體莖尖的超低溫保存方法，其主要基于小滴玻璃化法超低溫保存技術，包括材料擴繁、莖尖剝取、預培養、裝載、PVS2處理、超低溫（-196℃）冷凍保存的步驟。

材料擴繁具體步驟如下：1）將矮牽牛試管苗接種在含0.5mg/L?BA和30g/L蔗糖的MS固體培養基上進行擴繁；2）將擴繁的試管苗轉移到不含激素的MS培養基中生根復壯，20d后，將生根苗轉到含30g/L蔗糖的MS培養基中培養；培養溫度為25±2℃，光照14h/d，光照強度為700lux。

莖尖剝取具體為：在無菌條件下，從繼代15-20d的生長健壯的矮牽牛無菌苗上剝取帶2-3片葉原基，直徑大小約2~3mm的離體莖尖為材料。

預培養具體為：將剝取的莖尖在含0.2~0.4mol/L蔗糖的MS液體培養基中，于25℃振蕩預培養1~3d，搖床轉速為60rpm/min。

裝載具體為：將預培養后的離體莖尖置于裝載液中室溫裝載20~40min；所述裝載液的組成為：MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。

PVS2脫水處理具體為：將裝載后的莖尖置于PVS2中，0℃處理30~50min；所述PVS2的組成為：MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖。

超低溫冷凍保存具體為：將經PVS2脫水處理后的莖尖置于鋁箔條上，向莖尖上滴加PVS2溶液，使莖尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后將鋁箔條直接浸入液氮中進行冷凍，冷凍后將鋁箔條裝入凍存管中，擰緊蓋子，最后投入液氮中保存。

本發明進一步提供利用上述方法獲得的矮牽牛離體莖尖在組織培養及植株再生中的應用。其包括：解凍、洗滌及恢復再生培養的步驟。具體為：將超低溫冷凍保存的離體莖尖取出，迅速投入卸載液中解凍并洗滌，然后將莖尖接種于恢復再生培養基中，在25±2℃下暗培養7d，最后移至光下培養。洗滌次數優選為2~3次，每10min更換一次卸載液。

所述卸載液的組成為：MS+1.2mol/L蔗糖；所述恢復再生培養基的組成為：MS+0.5mg/L?BA+30g/L蔗糖+9.0g/L瓊脂。

本發明的矮牽牛試管苗離體莖尖小滴玻璃化法超低溫保存及植株再生培養方法，是一種長期安全、穩定可靠、簡單有效的保存矮牽牛種質資源的方法，再生苗恢復生長良好，植株再生率可達50％以上。

附圖說明