[發明專利]矮牽牛離體莖尖的超低溫保存方法

有效

• 申請號: 201210229180.1
• 申請日: 2012-07-03
• 公開（公告）號: CN102726298A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 陳曉玲;黃斌;張金梅;盧新雄;辛霞
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N3/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

1.一種矮牽牛離體莖尖的超低溫保存方法，其包括材料擴繁、莖尖剝取、預培養、裝載、PVS2處理、超低溫冷凍保存的步驟。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，材料擴繁具體步驟如下：

1）將矮牽牛試管苗接種在含0.5mg/L?BA和30g/L蔗糖的MS固體培養基上進行擴繁；

2）將擴繁的試管苗轉移到不含激素的MS培養基中生根復壯，20d后，將生根苗轉到含30g/L蔗糖的MS培養基中培養；培養溫度為25±2℃，光照14h/d，光照強度為700lux。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，莖尖剝取具體為：在無菌條件下，從繼代15-20d的矮牽牛無菌苗上剝取帶2-3片葉原基，直徑大小約2~3mm的離體莖尖為材料。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，預培養具體為：將剝取的莖尖在含0.2~0.4mol/L蔗糖的MS液體培養基中，于25℃振蕩預培養1~3d，搖床轉速為60rpm/min。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，裝載具體為：將預培養后的離體莖尖置于裝載液中室溫裝載20~40min；所述裝載液的組成為：MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，PVS2處理具體為：將裝載后的莖尖置于PVS2中，0℃處理30~50min；所述PVS2的組成為：MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，超低溫冷凍保存具體為：將經PVS2脫水處理后的莖尖置于鋁箔條上，向莖尖上滴加PVS2溶液，使莖尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后將鋁箔條直接浸入液氮中進行冷凍，冷凍后將鋁箔條裝入凍存管中，擰緊蓋子，最后投入液氮中保存。

8.根據權利要求1-7任一項所述方法獲得的矮牽牛離體莖尖在組織培養中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，將超低溫冷凍保存的離體莖尖取出，投入卸載液中解凍并洗滌，然后將莖尖接種于恢復再生培養基中，在25±2℃下暗培養7d，最后移至光下培養；

所述卸載液的組成為：MS+1.2mol/L蔗糖；所述恢復再生培養基的組成為：MS+0.5mg/L?BA+30g/L蔗糖+9.0g/L瓊脂。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，洗滌次數為2~3次，每10min更換一次卸載液。