[發(fā)明專利]天山凍土中產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株篩選及培養(yǎng)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210228732.7
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN102864099A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊瑞金;祁丹丹;趙偉
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12N9/52;C12R1/38
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從新疆天山凍土中篩選得到的產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株P(guān)seudomonas?sp.(假單胞菌屬)N-8；本發(fā)明還涉及該菌株的特性及發(fā)酵條件的優(yōu)化。?

背景技術(shù)

天山凍土屬于我國高海拔高山常年凍土，凍土環(huán)境中微生物產(chǎn)生一系列適應(yīng)低溫、寡營養(yǎng)、強(qiáng)輻射、凍融等極端因子的分子機(jī)制，為低溫微生物生理多樣性提供了可能。低溫酶由于在低溫環(huán)境下具有較高的酶活性，有助于在保證催化效率的前提下降低反應(yīng)溫度和縮短反應(yīng)時間，從而大幅度節(jié)約能源，因而在食品加工、日化產(chǎn)品、皮革加工等需要低溫催化的行業(yè)如中具有較高的開發(fā)利用價值。目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)低溫蛋白酶的菌有假單胞菌屬(Psedomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單孢菌屬(Aeromonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、弧菌屬(Vibrio)。這些低溫菌在永久性低溫環(huán)境下經(jīng)過長期的進(jìn)化適應(yīng)，已有著適應(yīng)低溫環(huán)境的特殊結(jié)構(gòu)與生理生化機(jī)制。它們所產(chǎn)生的低溫蛋白酶也有著獨(dú)特的生理生化特征與結(jié)構(gòu)特征。有關(guān)低溫微生物的資源勘探與代謝活性產(chǎn)物研究，已成為國際微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，我國的一些研究機(jī)構(gòu)也積極開展低溫蛋白酶生產(chǎn)菌株的篩選工作。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的：從新疆天山凍土中篩選得到的產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株，經(jīng)鑒定為假單胞菌N-8(Pseudomonas?sp.N-8)，2012年6月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國.武漢.武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCC?NO：M?2012251。通過單因素試驗和正交實(shí)驗對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。?

1、菌株篩選方法，包括以下步驟：?

(1)初篩：吸取富集后的培養(yǎng)液用倍比稀釋法制不同的稀釋度移入初篩平板中，涂勻，15℃培養(yǎng)。待菌落長好后，挑選透明圈較大菌株，斜面保存。?

(2)復(fù)篩：以40℃為上限生長溫度，即在該溫度不生長的菌株為耐冷菌。將初篩得到的產(chǎn)蛋白酶菌株在初篩平板上點(diǎn)樣，在40℃不生長的菌株，為試驗菌株。以酪蛋白為底物，采用福林(Folin)試劑顯色法測定酶活，進(jìn)一步篩選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。?

2、菌株生長特性、形態(tài)觀察及生理生化試驗?

(1)生長特征：該菌株生長范圍為0-40℃，最適生長溫度為20℃，最適生長pH為7.0；?

(2)菌體特征：革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，細(xì)胞單個，大小為(0.5-0.8)×(2.0-3.2)μm，有莢膜，有鞭毛；?

(3)菌落特征：在酪蛋白平板上，菌落呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，產(chǎn)生明顯的透明圈；?

(4)生理生化特征：該菌株接觸酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽(還原)反應(yīng)為陽性，能水解明膠，硫化氫試驗、伏一普二氏試驗(VP)、甲基紅試驗(MR)為陰性，不能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、鼠李糖、棉子糖。?

3、發(fā)酵條件優(yōu)化：?

(1)通過單因素試驗和正交實(shí)驗對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。?

表1培養(yǎng)基組成的正交試驗設(shè)計與結(jié)果?

根據(jù)表1中極差分析結(jié)果表明，各因素對產(chǎn)酶的影響大小順序為：酪蛋白＞酵母粉＞葡萄糖＞K⁺；最佳培養(yǎng)基配方為(g/L)：葡萄糖10，酵母粉8，酪蛋白20，K⁺0.4；按最佳組合測定發(fā)酵液酶活為47.34U/mL。?

(2)通過單因素試驗和正交實(shí)驗對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。?

表2培養(yǎng)條件的正交試驗設(shè)計與結(jié)果?

根據(jù)表2中極差分析結(jié)果表明，各因素對產(chǎn)酶的影響大小順序為：種齡＞起始pH＞接種量＞裝液量；最佳培養(yǎng)條件為：種齡24h，起始pH?7，接種量4％，裝液量50mL/250mL。按最佳組合測定發(fā)酵液酶活為49.56U/mL。?

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1。產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株P(guān)seudomonas?sp.(假單胞菌屬)N-8的分離培養(yǎng)。?

富集培養(yǎng)：將取自新疆天山的凍土5g放到50ml無菌水中制成土壤懸浮液，搖勻，在超凈臺內(nèi)用移液槍吸1ml搖勻的土壤懸浮液，加到50mLPYG富集培養(yǎng)基中，15℃，200rpm培養(yǎng)2天。?