[發明專利]一種茶樹組培再生體系建立的方法

無效

• 申請號: 201210227942.4
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN102726296A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 高麗萍;王婕;劉亞軍;貢年娣
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01G31/00
• 代理公司: 合肥金安專利事務所 34114
• 代理人: 金惠貞

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及到一種茶樹組織培養再生體系建立的方法。

背景技術

植物組織培養是以細胞全能性為理論基礎建立的一種離體培養技術。自20世紀初建立以來，廣泛應用于植物的快速繁殖、品種改良、基因工程育種等方面^[1]。茶樹再生體系或組織培養技術是建立茶樹遺傳轉化體系的基礎，后者是進行基因功能驗證、茶樹工程基因育種、茶樹次生代謝研究的重要技術平臺。遺憾的是，由于缺乏合適的再生體系，迄今茶樹遺傳轉化體系沒有建立，限制了茶樹基因工程、代謝工程的發展。1969年，佛利斯特作為先驅者就開始了茶樹組織培養的研究^[2]。如果不考慮遺傳轉化的話，實際上茶樹的組織培養已經較為成熟。茶樹的嫩枝、莖節間和茶籽是常用的外植體，而腋芽增殖是主要的增殖方式。班納吉^[3]、巴格^[4]?、蒙達爾^[5]?和孫俊^[6]等采用成熟大田茶樹嫩枝或實生苗的莖節間為外植體，通過腋芽或不定芽增殖形式進行再生實驗，這種方式具有遺傳穩定、增殖率高的特點，但是由于外植體的酚類物質含量高，難以進行茶樹遺傳轉化。種子也是茶樹再生理想的外植體，吳振鐸^[7]、加藤^[8-9]、和蒙達爾^[10]等均利用種子誘導出體細胞胚，并進一步利用體細胞胚再生出植株。實驗證明，體細胞胚是茶樹遺傳轉化的理想對象，蒙達爾^[11]甚至利用這種方式成功得到茶樹第一個轉基因植株，但是在這種方式中，體細胞胚的誘導和增殖是技術難點。雖然體細胞胚的誘導較為困難，但是胚性愈傷組織的誘導則較為簡單。

發明內容

為了給茶樹遺傳轉化奠定基礎，本發明提供一種茶樹組培再生體系建立的方法。

一種茶樹組培再生體系建立的具體操作步驟如下：

1.1愈傷組織的誘導

采摘9月下旬生理成熟的茶籽作為茶樹再生體系的原材料，即外植體；取茶籽5～10顆，將綠色的外殼剝去，用濃度75%的乙醇浸泡30秒，用無菌水洗3～4次；再用濃度0.1%的升汞溶液浸泡10分鐘，用無菌水洗3～4次；在超凈條件下剝去種皮，選取完整的、帶有胚的剝去種皮的茶樹籽接種于普通B₅培養基上，接種量為每40毫升接3～4顆；培養2周，有茶樹愈傷組織長出；所述普通B₅培養基中加入了二氯苯氧基乙酸和6-糠氨基嘌呤，其中二氯苯氧基乙酸的加入量為2.5mg/L，6-糠氨基嘌呤的加入量為0.5mg/L；

1.2愈傷組織的繼代和增殖

將茶樹愈傷組織切下，并切成直徑6～10毫米愈傷組織塊，培養于普通B₅培養基上，接種量每40毫升接5～10塊；培養條件為黑暗、溫度為25～28度；每21天更換一次新鮮的普通B₅培養基；培養3周，得到鮮重可以增殖為原來的1.8～2.2倍的增殖愈傷組織；在此條件下，該愈傷組織可以穩定繼代4年；

1.3不定芽的誘導，

將增殖愈傷組織接種到不定芽誘導培養基上，接種量每40毫升接直徑6～10毫米大小的愈傷組織5～10塊；培養條件為12小時光照和12小時黑暗交替，溫度為25～28度，光強為3000～6000勒克司；每4周更換一次不定芽誘導培養基；培養到第3周，有部分愈傷組織轉綠；培養到第4周，不定芽的誘導率為15.71%，培養到2個月，誘導率上升為24.29%，培養到4個月，誘導率高達65.71%；所述不定芽誘導培養基以MS培養基為基礎，加入吲哚丁酸和6-芐基腺嘌呤，其中吲哚丁酸的加入量為0.1mg/L，6-芐基腺嘌呤的加入量為2.5mg/L；

1.4不定芽的增殖

將新誘導出的不定芽切下，栽插到不定芽增殖培養基上，栽插量每100毫升接1～3棵；培養條件為12小時光照和12小時黑暗交替，溫度為27度，光強為4000勒克司；培養3周，大量的叢生芽長出；在此條件下，可以不斷增殖不定芽；所述不定芽增殖培養基以MS培養基為基礎，加入吲哚丁酸和苯基噻二唑基脲，其中吲哚丁酸的加入量為?0.1mg/L、苯基噻二唑基脲的加入量為0.015mg/L；

1.5壯苗