[發明專利]甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012，由其制備得到的疫苗及應用

有效

• 申請號: 201210226440.X
• 申請日: 2012-06-29
• 公開（公告）號: CN102757941A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 呂宏亮;張澍
• 申請（專利權）人: 北京健翔和牧生物科技有限公司;山西隆克爾生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/08;A61K39/29;A61P31/14;A61P1/16;G01N33/576;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

1.一株甲型肝炎病毒株，命名為HAV-ZL2012，其由該病毒株的傳染性克隆感染細胞后產生，所述的該病毒株的傳染性克隆存在于甲型肝炎病毒工程菌中，所述的甲型肝炎病毒工程菌，命名為pHAV-ZL2012/DH5α，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為：CGMCC?No.6215，保藏日期為2012年6月14日。

2.權利要求1所述的甲型肝炎病毒株在制備預防由甲型肝炎病毒引起的疾病的藥物中的應用。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的藥物為甲肝減毒活疫苗或甲肝滅活疫苗。

4.權利要求1所述的甲型肝炎病毒株在制備甲肝的診斷試劑中的應用。

5.一種甲肝疫苗，其特征在于所述的疫苗中含有權利要求1所述的甲型肝炎病毒株。

6.如權利要求5所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗為甲肝減毒活疫苗或甲肝滅活疫苗。

7.一種使甲型肝炎病毒株快速減毒適應的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）將甲型肝炎病毒株在FRhK6的單層細胞上傳代10次后，轉至Vero細胞，Vero細胞傳至第10代，病毒培養液經ELISA-TCID₅₀測定病毒滴度，RT-PCR檢測陽性；

（2）在二倍體細胞上的減毒適應

將步驟1中得到的在Vero細胞上傳至第10代的細胞，按0.01-0.1MOI接種單層二倍體MRC-5細胞，傳至5-8代，病毒培養液經ELISA-TCID₅₀測定病毒滴度，RT-PCR檢測陽性，得到所述病毒株的二倍體細胞適應株；

（3）二倍體細胞適應株在Vero細胞上的傳代和適應

細胞培養瓶形成Vero細胞單層后用不含胎牛血清的MEM培養液洗3次，接種人二倍體細胞上適應的甲肝病毒株，經32℃4小時的吸附，每隔1周換液1次，每4周至6周傳代一次，每次傳代細胞經凍融超聲，經5-7次傳代后，病毒液按10-100倍稀釋，用ELISA測定滴度，繼續在32℃下每2周傳代一次，傳至25-30代次時，進行RT-PCR檢測；

（4）中和實驗或免疫電鏡觀察

步驟3得到的培養物經凍融、超聲處理，離心，取上清液0.05ml加入0.02ml人的免疫血清后，以1:10或1:20的體積比與稀釋液混合，在37℃孵育1小時，4℃冰箱放置3小時，進行電鏡觀察，混合液接種二倍體單層細胞，培養二周，RT-PCR檢測結果陽性，用ELISA-TCID₅₀檢測不到病毒滴度，即得。