[發(fā)明專利]一種基于雙針孔的超分辨顯微方法和裝置

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210226309.3
• 申請(qǐng)日: 2012-06-29
• 公開（公告）號(hào): CN102735670A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 匡翠方;王軼凡;顧兆泰;李帥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N21/21;G02B21/06
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于超分辨顯微領(lǐng)域，特別涉及一種基于雙針孔的超分辨顯微方法和裝置。

背景技術(shù)

共焦顯微鏡最早是由M.Minsky于1957年提出，最初目的是為了消除普通光學(xué)顯微鏡在探測樣品時(shí)產(chǎn)生的散射光影響。之后，共焦顯微術(shù)因其出色的三維層析能力和高分辨率等特點(diǎn)迅速得到推廣。然而，盡管共焦顯微鏡使其橫向分辨率提高到相同孔焦比的普通光學(xué)顯微鏡的1.4倍，但與其軸向分辨率相比仍差兩個(gè)數(shù)量級(jí)，橫向分辨率和軸向分辨率之間存在著極大的不平衡，因此進(jìn)一步改善共焦顯微系統(tǒng)的成像分辨率特別是橫向分辨率變得尤為迫切。

起初，人們通過增大物鏡數(shù)值孔徑NA和減小光波波長等方法來改善共焦系統(tǒng)的成像分辨能力，但是很快發(fā)現(xiàn)了這類方法的局限性，光學(xué)衍射極限制約了共焦顯微系統(tǒng)成像分辨率的進(jìn)一步提高。超分辨思想最先于1952年由Francia提出，但是直到共焦顯微技術(shù)的出現(xiàn)和針孔的使用才使光學(xué)超分辨真正具有了實(shí)際意義。為了打破光學(xué)衍射極限的限制，從根本上改善共焦顯微鏡的成像分辨率，人們嘗試了許多方法，例如4PI共焦顯微鏡、共焦干涉顯微鏡、基于非線性效應(yīng)的雙光子或多光子顯微鏡和基于針孔差分的差動(dòng)共焦顯微鏡等方法。

國內(nèi)學(xué)者針對(duì)基于針孔差分的差動(dòng)共焦顯微鏡也做了比較深入的研究，例如，趙維謙等人提出了具有高空間分辨力的差動(dòng)共焦掃描檢測方法，并申請(qǐng)了相關(guān)專利(申請(qǐng)專利號(hào)CN200410006359.6)。但是基于針孔的超分辨方法并不僅僅局限于上述專利中的方法，本發(fā)明提出一種基于雙針孔的超分辨顯微方法和裝置，與上述專利中通過移動(dòng)針孔進(jìn)行差分的差動(dòng)共焦顯微術(shù)不同，本發(fā)明通過對(duì)兩個(gè)在不同大小針孔的濾波作用下的共焦信號(hào)進(jìn)行分析和處理，橫向分辨率得到顯著改善，實(shí)現(xiàn)了橫向超分辨。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種基于雙針孔的超分辨顯微方法和裝置，裝置結(jié)構(gòu)簡單，易于操作，共焦顯微系統(tǒng)的橫向分辨率顯著改善，實(shí)現(xiàn)了橫向超分辨，可用于光學(xué)顯微領(lǐng)域以及納米高精度檢測、測試和制造等領(lǐng)域。

一種基于雙針孔的超分辨顯微方法，包括激光器發(fā)射出的光束聚焦到樣品的表面形成信號(hào)光，將該信號(hào)光分為強(qiáng)度相等的兩束光，這兩束光分別通過第一針孔和第二針孔后進(jìn)入相應(yīng)探測器并進(jìn)行對(duì)應(yīng)的處理，所述第一針孔面積為0.5～2個(gè)愛里斑，所述第二針孔面積為2～5個(gè)愛里斑。

針對(duì)非熒光樣品，信號(hào)光為光束聚焦到樣品表面產(chǎn)生的反射光和散射光，針對(duì)熒光樣品，信號(hào)光為光束聚焦到樣品表面激發(fā)的熒光。

優(yōu)選的，所述第一針孔面積為1.5個(gè)愛里斑，所述第二針孔面積為4.5個(gè)愛里斑。

所述第一針孔面積選擇1.5個(gè)愛里斑的原因是為了與聚焦到樣品表面的光斑大小匹配從而構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦系統(tǒng)，所述第二針孔的面積選擇4.5個(gè)愛里斑的原因是為了與所述第一針孔的1.5個(gè)愛里斑的大小匹配以獲得最好的處理結(jié)果。

優(yōu)選的，所述第二針孔為環(huán)形孔，所述環(huán)形孔的中心不透光面積為1.5個(gè)愛里斑，所述環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和為4.5個(gè)愛里斑。

第二針孔可替換為環(huán)形孔，環(huán)形孔的中心不透光面積在0.5～2個(gè)愛里斑之間，環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和在2～5個(gè)愛里斑之間，環(huán)形孔所在平面與于第二針孔所在平面重合，環(huán)形孔中心與于第二針孔中心重合。

針對(duì)非熒光樣品，本發(fā)明提供了一種基于雙針孔的超分辨顯微裝置，包括用于發(fā)出光束的激光器，沿所述光束的光路依次布置的偏振片、偏振分束器、四分之一波片、第一透鏡和用于承載待測樣品的納米平移臺(tái)，依次布置在所述偏振分束器的反射光路上的第二透鏡和分束器，分別用于對(duì)所述分束器射出的第一測量光和第二測量光進(jìn)行濾波的第一針孔和第二針孔，以及收集通過所述第一針孔和第二針孔的光強(qiáng)信號(hào)的探測系統(tǒng)，所述第一針孔面積為0.5～2個(gè)愛里斑，所述第二針孔面積為2～5個(gè)愛里斑。

探測系統(tǒng)由第一探測光纖、第一探測器、第二探測光纖、第二探測器和計(jì)算機(jī)組成。其中，第一探測光纖和第二探測光纖參數(shù)和性能完全相同，且兩光纖端面面積足夠收集通過兩針孔的全部光強(qiáng)。

優(yōu)選的，所述第一針孔面積為1.5個(gè)愛里斑，所述第二針孔面積為4.5個(gè)愛里斑。

所述第一針孔面積選擇1.5個(gè)愛里斑的原因是為了與聚焦到樣品表面的光斑大小匹配從而構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦系統(tǒng)，所述第二針孔的面積選擇4.5個(gè)愛里斑的原因是為了與所述第一針孔的1.5個(gè)愛里斑的大小匹配以獲得最好的處理結(jié)果。

優(yōu)選的，所述第二針孔為環(huán)形孔，所述環(huán)形孔的中心不透光面積為1.5個(gè)愛里斑，所述環(huán)形孔的透光部分與中心不透光部分面積之和為4.5個(gè)愛里斑。