[發明專利]利用轉基因植物生產蝦青素的方法

有效

• 申請號: 201210223297.9
• 申請日: 2012-07-02
• 公開（公告）號: CN102888425A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 黃俊潮;鐘玉娟;姜悅
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明植物研究所;潤科生物工程（福建）有限公司
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;A01H5/00;C12N1/21;C12N5/10;C07C403/24;A23L1/29;A23K1/14;A61K8/97;A61Q19/08;A61K8/35
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙) 53108
• 代理人: 馬曉青

技術領域：

本發明屬于植物基因工程領域，涉及利用轉基因植物生產目的物的方法。特別涉及構建植物載體，通過其獲得重組宿主細胞，并獲得產蝦青素的轉基因植物的方法。

背景技術：

蝦青素（3，3’-二羥基4，4’-二酮基β-胡蘿卜素）是酮式類胡蘿卜素，是自然界中最強的抗氧化劑，其抗氧化活性是維生素Ｅ的５００倍，也遠高于其他常用的抗氧化劑。醫學研究證明蝦青素具有保護皮膚和眼睛，提高免疫力，抗心血管疾病，抗炎，抗腫瘤，抗衰老等生物學功能。蝦青素廣泛存在于水生生物，如微藻和水生動物（動物本身不能合成，必須通過食物鏈獲得）。人類主要通過食用水產品來獲得蝦青素。人工養殖的水產品其蝦青素來源于添加于其喂養飼料的化學合成蝦青素。人工蝦青素含有多種對人體有害的物質，它的使用無疑造成食物鏈的污染。隨著各國對化工產品用于養殖業的嚴格限制,?人工蝦青素遲早要退出市場。

蝦青素的生物合成只發生于少數生物且其產量通常很低。雨生紅球藻是自然界中蝦青素含量最高的生物，是目前唯一用于商業化生產天然蝦青素的單細胞真核綠藻（植物的祖先）。然而雨生紅球藻生長慢，對生長環境敏感，不能象螺旋藻那樣進行大規模低成本養殖。利用雨生紅球藻商業化生產天然蝦青素是近十年的事情。因投入大，技術要求高，同時受制于雨生紅球藻自身的遺傳特性，目前雨生紅球藻養殖企業只能以小的生產規模和較高的生產成本來生產蝦青素。這是造成天然蝦青素價格高昂和供不應求的主要原因。

一直以來，人們試圖通過優化雨生紅球藻培養條件或篩選突變體來解決蝦青素的生產問題，但迄今未獲得突破性進展。近十年來不斷有嘗試將雨生紅球藻等微生物蝦青素合成途徑關鍵酶基因表達于模式生物，如大腸桿菌，酵母以及模式植物并取得一定的成功。其中以葉綠體基因組轉化表達細菌來源的加氧酶基因的煙草蝦青素含量最高（Hasunuma?T,?et?al.?Plant?Journal?2008,?55:857-868），但其含量只及雨生紅球藻的十分之一以下，遠未達低成本產業化生產水平。限制植物高效合成和積累蝦青素的主要原因是植物內源高活性的β-胡蘿卜素羥化酶（BHY）使羥化β-胡蘿卜素占絕對優勢而典型的β-胡蘿卜素加氧酶（BKT）難以催化羥化β-胡蘿卜素成蝦青素。分離和功能分析新型BKT并將其高效表達于含有大量類胡蘿卜素的植物特異組織和器官，如番茄的果實，胡蘿卜的塊根等是解決這一難題的關鍵所在。

發明內容：

本發明的目的是針對現有技術存在的上述問題，提供一種利用基因工程技術使植物高效合成和積累蝦青素的方法。

為實現上述目的，本發明采取了以下技術方案：

植物表達載體pBI121-LTPCRBKT和pBI121-BHYBKT，通過來自衣藻的β-胡蘿卜素加氧酶BKT和來自雨生紅球藻的β-胡蘿卜素羥化酶BHY基因連接到有引導基因產物定位的植物葉綠體信號肽序列，與信號肽序列讀碼框正確接合后插入到植物表達載體pBI121上所獲得。

本發明的植物表達載體pBI121-LTPCRBKT和pBI121-BHYBKT，是通過如下方法構建而得：

將番茄核酮糖羧化酶小亞基葉綠體導肽序列LTP插入到含有CRBKT的細菌表達載體pCRBKT得到載體pLTPCRKBT，再將LTP+CRBKT核苷酸片段酶切下來插入到植物表達載體pBI121?上得到表達載體pBI121-LTPCRBKT；

將pBI121-LTPCRBKT用HPBHY替代CRBKT片段得到pBI121-LTPHPBHY，再將該載體上的CaMV35S::SlTpHpBHY::nos序列通過PCR擴增和酶切后插入載體pBI121-LTPCRBKT上的ClaI位點上得到載體pBI121-BHYBKT。

應用本發明的植物表達載體pBI121-LTPCRBKT和pBI121-BHYBKT建立產蝦青素轉基因植物的方法，包括構建含有β-胡蘿卜素加氧酶ＢＫＴ和β-胡蘿卜素羥化酶ＢＨＹ的植物表達載體pBI121-LTPCRBKT和pBI121-BHYBKT，然后用農桿菌介導的方法得到ＢＫＴ和ＢＨＹ在轉基因植株中表達并催化植物本身的類胡蘿卜素生成蝦青素的轉基因植株步驟。

本發明上述的基因β-胡蘿卜素加氧酶ＢＫＴ和β-胡蘿卜素羥化酶ＢＨＹ和重組載體pBI121-LTPCRBKT和pBI121-BHYBKT在制備重組宿主細胞中的應用，所述的重組宿主細胞是由農桿菌經熱激法獲得所述重組載體所制得。