[發明專利]青蟹雙順反子病毒檢測用引物組、檢測方法和快速診斷試劑盒

有效

• 申請號: 201210223292.6
• 申請日: 2012-06-29
• 公開（公告）號: CN102766700A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 郭志勛;張迪;馮娟;蘇友祿;徐力文
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

技術領域

本發明涉及一種青蟹雙順反子病毒檢測用引物組、檢測方法和快速診斷試劑盒。

背景技術

擬穴青蟹(Scylla?paramamosain)（原被鑒定為鋸緣青蟹（Scylla?serrata））因肉質鮮美、生長迅速、分布廣泛，是我國海洋漁業重要的養殖品種。但隨著養殖規模的逐步擴大，病害問題也不斷嚴重。青蟹雙順反子病毒（Mud?Crab?Dicistrovirus，MCDV）是在近幾年的染病青蟹中新發現的一種病原體。感染MCDV的擬穴青蟹體色沒有明顯變化，食欲不振，活動乏力，即使白天也不會潛入沙中，可導致很高的死亡率。該病毒屬于單正鏈RNA，雙順反子病毒科。由于發現較晚，相關研究很少。MCDV能通過浸泡、禁食浸泡、投喂、共居的方式感染擬穴青蟹。到目前為止，對于MCDV感染還沒有有效的治療方法，杜絕傳染源、防止病毒的傳染和流行是能夠采取的主要措施，早期快速診斷雙順反子病毒是減少損失的有效途徑，因此，簡便快速、特異性好、靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法對于疾病的預防具有重要意義。

環介導等溫擴增技術（1oop-mediated?isothermal?amplification，簡稱LAMP技術），是一種體外擴增特異DNA片段的技術，具有快速、敏感、特異性強等特點，主要是利用4種不同的特異性引物（引物F3、引物B3、引物FIP和引物BIP）識別靶基因的6個特定區段，在聚合酶和等溫條件下高效、快速、高特異地擴增靶序列，擴增反應結束后，可通過目測、染色劑及電泳多種方法對反應產物進行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都選用具有鏈置換特性的DNA聚合酶，如Bst?DNA聚合酶。對LAMP來說，4種特異性引物的設計是其關鍵所在。

LAMP因其自身的優點，現已被廣泛用于病原微生物，包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲等病傳染性疾病的檢測和診斷中，但尚未見有將LAMP用于擬穴青蟹雙順反子病毒檢測的相關報道。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種對青蟹雙順反子病毒具有高特異性，可用于環介導等溫擴增技術檢測青蟹雙順反子病毒的引物組。

本發明的目的還在于提供一種用上述引物組對青蟹雙順反子病毒進行快速、高效、高特異性檢測的方法。

本發明的最后一個目的在于提供含有上述引物組的快速診斷試劑盒。

本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的：一種青蟹雙順反子病毒檢測用引物組，該引物組由如下四條引物組成：

內引物FIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；

內引物BIP，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。

本發明的青蟹雙順反子病毒檢測用引物組，是基于環介導等溫擴增技術，根據已公開的青蟹雙順反子病毒基因組序列，選取青蟹雙順反子病毒基因的特異性序列，然后分析設計出的，能專一性鑒別青蟹雙順反子病毒的特異性引物組，其能通過PCR來鑒定青蟹雙順反子病毒基因。

引物設計是LAMP技術的關鍵所在，對于引物設計有許多的要求，如各個引物之間的距離、T_m值以及引物末端穩定性等，因此從200~300個堿基的靶序列中設計四條符合要求的引物存在很大的難度，而本發明根據靶基因序列設計了一種青蟹雙順反子病毒檢測用引物組，能特異性識別靶序列上的六個獨立區域，在Bst?DNA聚合酶的作用下啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA區啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖-環DNA混合物，由于LAMP技術只有在四條引物完全識別靶序列六個結合區的情況下才能順利進行，所以本發明的引物組在很大程度上減少了擴增反應的背景影響，大大改善了青蟹雙順反子病毒檢測的特異性。

本發明的第二個目的是通過如下技術方案來實現的：一種青蟹雙順反子病毒的檢測方法，該方法是利用上述的引物組通過LAMP反應和反應后的顯色反應，對待測樣品中是否含有青蟹雙順反子病毒進行檢測。

本發明中的青蟹雙順反子病毒的檢測方法，具體含以下步驟：

(1)提取待測樣品核酸后反轉錄的cDNA；

(2)向反應容器中加入上述青蟹雙順反子病毒檢測用引物組、LAMP反應液和Bst?DNA聚合酶，恒溫反應；

(3)反應結束后，向反應管中加入顯色液，混勻，通過觀察顏色判斷待測樣品中是否含有青蟹雙順反子病毒。