[發明專利]一種利用人體廢棄胚胎建立人胚胎干細胞系的方法

無效

• 申請號: 201210221563.4
• 申請日: 2012-06-30
• 公開（公告）號: CN102703381A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 孫瑩璞;王芳;孔慧娟;李婧;戴善軍;辛志敏;金海霞;宋文妍;姚桂東
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

技術領域

本發明涉及醫學領域，特別是一種利用人廢棄胚胎建立人胚胎干細胞系的方法。

背景技術

人胚胎干細胞（hESCs）是唯一可分化為含生殖細胞在內所有體細胞的干細胞。1998年人胚胎干細胞首次建系，目前已成功將hESCs誘導分化出幾乎所有3個胚層的細胞類型，但定向分化機制、細胞移植等研究亟待進一步深入。我國明確將“干細胞研究”作為國家中長期發展規劃重要資助項目，將該領域作為趕超國外先進研究水平的突破點。2003年國家科技部、衛生部為促進我國干細胞研究的迅速開展，聯合下發了“人胚胎干細胞研究的倫理指導原則”，為干細胞研究提供了倫理保障。但截止2010年底，在美國國立衛生研究院網站上登記的hESCs系僅64株，且多個細胞系存在問題，hESCs株遠不能滿足應用的需要，目前國內尚無一株人胚胎干細胞系在NIH注冊成功，因此，亟需一種高效的建立胚胎干細胞系的方法。

發明內容

針對上述情況，為解決現有技術之缺陷，本發明的目的就是提供一種利用人廢棄胚胎建立人胚胎干細胞系的方法，可有效解決現有人胚胎干細胞的建立方法操作復雜，需要大量的胚胎，成本高，成功率低，人胚胎干細胞系遠不能滿足應用的需要的問題。

本發明的技術方案是，收集并培養廢棄胚胎，分別制備小鼠胚胎成纖維細胞和小兒包皮成纖維細胞，按照0.55~0.65×10⁵個/cm²的密度，混合上述細胞制備成混合飼養層，采用機械法分離廢棄胚胎的內細胞團，將分離的內細胞團置于混合飼養層上培養，建立人胚胎干細胞系。

本發明操作簡單，可以有效利用臨床上大量廢棄的新鮮及冷凍胚胎，并利用最佳鋪皿密度，節約了飼養層細胞，大大降低了建立胚胎干細胞系的成本，為將來進一步開發利用胚胎干細胞奠定了基礎。

具體實施方式

以下對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。

本發明包括以下步驟：

（1）收集并培養廢棄胚胎：收集新鮮的廢棄胚胎或對冷凍的胚胎進行解凍

收集新鮮的廢棄胚胎，其方法為：將2-3天的不適合移植和冷凍的廢棄胚胎，移入胚胎培養液微滴中（卵裂期胚胎移入卵裂期胚胎培養液，囊胚期胚胎移入囊胚培養液中），置于35~38℃、體積濃度為4~6％的CO₂培養箱中培養至第5～7天，每日觀察更換培養液；

對冷凍的胚胎進行解凍：從液氮中取出裝有胚胎的麥管，室溫氣浴30s，31℃水浴30s，用無菌剪刀剪斷麥管，斷端接一段帶空氣的注射器，剪斷另一端，將胚胎吹入空的器皿中，加入0.8ml的解凍液①，10min后依次移入0.8ml解凍液①＋②，解凍液②，解凍液②＋③，各5min，胚胎移入解凍液③制成的微滴，逐滴漂洗，移入最后一個微滴中，37℃孵育10min后移入胚胎培養液中；

胚胎解凍液配制：所述的解凍液①為摩爾濃度為0.5M的蔗糖解凍液（市售產品，SIGMA公司，型號8005）；解凍液②為摩爾濃度為0.?2M的蔗糖解凍液（市售產品，SIGMA公司，型號8007）；解凍液③為HEPES-緩沖HTF含12mg/mlHSA（市售產品，SIGMA公司，型號8013）；解凍液①＋②為解凍液①和解凍液②等體積混合的混合液；解凍液②＋③為解凍液②和解凍液③等體積混合的混合液；?

所述的胚胎培養液包括卵裂期胚胎培養液和囊胚培養液，卵裂期胚胎移入卵裂期胚胎培養液，囊胚期胚胎移入囊胚培養液中；所述的卵裂期胚胎培養液微滴為1ml體積濃度10%的血清替代品（serum?protein?substitute，SPS，市售產品，SAGE公司）加入9ml?Quinn’s-1026（市售產品，SAGE公司）配成卵裂期胚胎培養液，在35mm的培養皿中做25μL微滴，覆蓋2ml礦物油，置于35~38℃、體積濃度為4~6％的CO₂培養箱中平衡過夜；

所述的囊胚培養液微滴為1ml體積濃度10%的血清替代品（市售產品，SAGE公司）加入9ml?Quinn’s-1029（市售產品，SAGE公司）配成囊胚培養液，在35mm的培養皿中做25μL微滴，覆蓋2ml礦物油，置于35~38℃、體積濃度為4~6％的CO₂培養箱中平衡過夜；

（2）飼養層細胞的制備：分別制備小鼠胚胎成纖維細胞和小兒包皮成纖維細胞